江西迷迭香精油的成分分析及抗氧化、抑菌活性研究

郭冬云，萬 娜,3*，吳 意，林瑞華，唐 欣，曹 嵐，伍振峰,2*，楊 明,2

1江西中醫藥大學 現代中藥制劑教育部重點實驗室；2江西中醫藥大學 創新藥物與高效節能降耗制藥設備國家重點實驗室； 3江西中醫藥大學 藥學院；4江西中醫藥大學 中藥資源與民族藥研究中心，南昌 330004

迷迭香(RosmarinusofficinalisL．)為唇形科迷迭香屬亞灌木，原產于地中海地區，現在世界各地均有種植，含有豐富的芳香油成分[1]。迷迭香香氣濃郁，常用于烹飪香料、食品工業的天然防腐劑，以及觀賞和藥用植物[2]。研究發現，在廣泛的草藥和香料中，迷迭香等具有較好的抗氧化活性[3]。

精油是植物新陳代謝過程中形成的次生產物，是一種具有高濃度芳香和揮發性的物質，存在于植物體內某些特殊器官，發揮各種生態功能[4,5]。由于精油具有多種生物活性，因而在食品工業、化妝品工業、植物療法、醫學等許多領域的應用不斷增長[6]。雖然合成的抗氧化劑和防腐劑已在食品工業中等領域被廣泛使用，但其長期使用會對人體健康造成一定危害。因此，近期許多研究都在尋找天然活性成分[7]。植物精油作為一種天然提取物，被提出作為合成抗氧化劑的潛在替代品。迷迭香精油是從其莖、葉、花等中經提取所得的是一種無色或淡黃色液體，具有植物特有的氣味，主要含有α-蒎烯、1,8-桉葉素、莰烯、樟腦、龍腦、石竹烯等萜類成分[8]。迷迭香精油具有抗氧化、抑菌及防腐等作用，在醫藥、食品工業和芳香療法等方面具有廣泛的使用價值[9-11]。本研究用水蒸氣蒸餾法提取江西產迷迭香葉精油，采用氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)對迷迭香精油成分進行分析，并對精油的抗氧化、抑菌活性進行研究，為綜合開發利用迷迭香精油資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

迷迭香(RosmarinusofficinalisL.)新鮮葉植物材料于2020年6月采自江西迭香果農業發展有限公司，經江西中醫藥大學楊明教授鑒定為唇形科植物迷迭香RosmarinusofficinalisL.的新鮮葉。標本(20200615)現存于江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室。

1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)(上海源葉生物科技有限公司)；鐵粉、30%過氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、無水乙醇、無水硫酸鈉等均為分析純；實驗用水為蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；硫酸慶大霉素(美倫生物科技有限公司)；刃天青(北京夢怡美生物科技有限公司)。

菌種：金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)、大腸桿菌(ATCC 25922)、枯草芽孢桿菌(ATCC 6633)均購自美國典型微生物菌種保存中心(American Type Culture Collection,ATCC)。

島津UV-2550紫外-可見光分光光度計(日本島津公司)；揮發油提取器(四川蜀牛玻璃儀器有限公司)；BT25S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；H2050R型大容量高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀實驗室開發有限公司)；HH-S恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫療儀器廠)；7890A/5975C型氣相-色譜質譜聯用儀(安捷倫科技有限公司)；LDZM-80KCS立式蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)；SPX-150F型生化培養箱(上海龍躍儀器設備有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 迷迭香精油的提取

采用水蒸氣蒸餾法提取精油，準確稱取100 g迷迭香鮮葉，置于5 000 mL圓底燒瓶中，加入2 000 mL雙蒸水，振搖混合后，浸泡30 min，置于電熱套中加熱并保持微沸狀態，加熱回流提取2 h，靜置分層后讀取精油的體積并收集精油。100 g迷迭香樣品提取得到精油的得率為1.12%。所得精油，加入無水硫酸鈉干燥后置于棕色玻璃瓶中，于4 ℃冰箱密封保存備用。

1.2.2 GC-MS分析條件

采用氣相色譜-質譜聯用法對迷迭香精油進行定性定量分析。氣相色譜條件：HP-5MS石英毛細管(30 m×320 μm×1.8 μm)色譜柱；采用程序升溫：起始溫度45 ℃，保持4 min，后運行70 ℃，再以4 ℃/min升溫至150 ℃，保持1 min，再以6 ℃/min升溫至250 ℃，于250 ℃保持4 min。載氣為高純氦氣，流量1.0 mL/min；進樣口溫度280 ℃；分流比80∶1；溶劑延遲4 min；進樣量為1.0 μL。

質譜條件：四極桿溫度150 °C；電離源為標準EI源，離子源溫度230 °C；電子倍增管電壓2 447.06 V；質量掃描范圍m/z為29～650。

采用峰面積歸一化法確定組分的相對含量；通過檢索NIST11化學工作站標準質譜圖庫，參閱有關文獻，鑒定組分的化學結構。

1.3 迷迭香精油抗氧化活性的測定

1.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定參考Liu等[12]的方法，并稍做修改。用無水乙醇配置1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。將精油樣品稀釋至不同濃度。取2 mL不同濃度的樣品與4 mL的DPPH溶液置于試管中，充分混勻，室溫暗處靜置30 min后，在517 nm處測定不同濃度樣品溶液的吸光度(A1)，同時測定2 mL樣品溶液與4 mL無水乙醇混合后的吸光度(A2)，以及4 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇混合后的吸光度(A0)。實驗平行測定3次，取平均值，DPPH自由基清除能力按公式(1)進行計算。

DPPH自由基清除能力=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(1)

1.3.2 羥基自由基清除能力的測定

羥基自由基清除能力的測定采用水楊酸法。取1 mL不同濃度的樣品，依次加入1 mL 10 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和1 mL 10 mmol/L的FeSO4，最后加入1 mL 8.8 mmol/L的H2O2啟動反應，37 ℃下水浴30 min，用蒸餾水調零，于510 nm波長下測吸光度(A1)。以蒸餾水代替樣品作為空白組測吸光度(A0)；以蒸餾水代替H2O2作為對照組測吸光度(A2)。實驗平行測定3次，取平均值，羥基自由基清除能力按公式(2)進行計算。

羥基自由基清除能力=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(2)

1.3.3 還原能力的測定

還原能力的測定采用普魯士藍還原法。取1 mL不同濃度的樣品，加pH 6.6的磷酸緩沖液2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻于50 ℃反應20 min，冷卻至室溫后加入10%三氯乙酸2.5 mL，混勻后以4 000 rpm的速度離心10 min，取上清液2.5 mL 與蒸餾水2.5 mL、0.1% 三氯化鐵溶液0.5 mL混勻，靜置室溫下反應10 min，于700 nm波長下測定吸光度(A)，實驗重復3次，取平均值。

1.4 迷迭香精油抑菌試驗

1.4.1 菌種的活化和菌懸液配制

將菌粉用自帶的復溶培養基制備成混合液體，用接種環蘸取混合液體，在營養瓊脂板上劃線，37 ℃恒溫培養箱培養24 h，待長出菌落，進行菌懸液制備。用接種環挑取單菌落于營養肉湯培養基中在37 ℃培養24 h，上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成1.5×108CFU/mL的菌懸液，4 ℃保存備用。

1.4.2 抑菌活性的測定

采用濾紙片法，通過測定抑菌圈直徑的大小來判斷迷迭香精油的抑菌效果。在超凈工作臺用移液槍吸取200 μL各種菌懸液，將其均勻地涂布于平板培養基表面，制成含菌平板。用無菌鑷子夾取6 mm的圓形濾紙片，用移液槍吸取10 μL精油滴加到濾紙片上，滴入的一面朝下貼于平板，三片一個板，正置20 min，以無菌水作為陰性對照，慶大霉素藥敏紙片(10 μg/片)作為陽性對照。將所有平板倒置于37 ℃的恒溫培養箱內培養24 h。采用十字交叉法測定抑菌圈的直徑，實驗平行3次取平均值。

1.4.3 最低抑菌濃度(MIC)的測定

采用微量稀釋法與刃天青顯色法[13]測定迷迭香精油的最低抑菌濃度(MIC)。在96孔無菌平板中，用2%吐溫-80的液體培養基將精油進行連續雙倍稀釋后，加入100 μL菌懸液混勻，最后加入20 μL 0.01%的刃天青溶液，置于37 ℃培養箱培養24 h，觀察顯色結果，顏色從藍色變為粉色即預示細菌生長。以保持藍色的最低濃度為MIC。第一行每孔加含2%吐溫-80的無菌營養肉湯200 μL作為培養基對照；第二行每孔加2%吐溫-80的無菌營養肉湯100 μL和菌懸液100 μL作為含菌陰性對照，每孔中菌數為5×104個；樣品行中每孔加入含2%吐溫-80的無菌營養肉湯100 μL，分別往第三行到第五行的1號孔加入100 μL的精油肉湯溶液(320 μL/mL),第六行的1號孔加入100 μL的硫酸慶大霉素母液(1 mg/mL),依次對第三行到第六行的1～12孔進行梯度稀釋后，在每孔中加入100 μL的菌懸液，在1～12孔的精油樣品最終濃度為160、80.0、40.0、20.0、10.0、5.00、2.50、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078 0 μL/mL。

2 結果與分析

2.1 迷迭香精油的化學成分分析

按上述GC-MS條件對迷迭香精油的化學成分進行分析，得到迷迭香精油的總離子流色譜圖(見圖1)。

圖1 迷迭香精油的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of the essential oil from R.officinalis

經GC-MS計算機數據處理系統進行自動檢索，通過與標準質譜圖經NIST11質譜庫檢索及人工輔助分析，鑒定確認了40種化學成分，用面積歸一化法計算出其相對含量。由表1可見，已鑒定成分的相對含量占精油總量的99.46%。其中含量較高的為α-蒎烯(39.05%)和1,8-桉葉素(16.86%)，其次是莰烯(4.22%)、D-檸檬烯(3.87%)、龍腦(3.74%)、β-石竹烯(3.11%)、香葉醇(2.92%)、β-蒎烯(2.23%)、樟腦(2.16%)、乙酸龍腦酯(2.01%)、芳樟醇(1.81%)、γ-松油烯(1.74%)等，為迷迭香精油的主要成分,相對含量高于1%的成分占91.41%。根據ISO國際標準分類[14]，迷迭香精油可分為突尼斯/摩洛哥型(Tunisian and Moroccan type)和西班牙型(Spanish type)兩大類，其中α-蒎烯的含量超過國際標準規定的最高含量，β-蒎烯、1,8-桉葉素、D-檸檬烯、龍腦的含量均符合西班牙型標準，樟腦含量低于標準規定的最低含量，因此從GC-MS分析結果，江西迷迭香精油屬于西班牙型。

表1 迷迭香精油化學成分Table 1 The chemical composition of the essential oil from R.officinalis

續表1(Continued Tab.1)

將江西迷迭香與國內其他產地迷迭香精油的化學成分進行比較[15-18]，結果見表2。

表2 不同產地迷迭香精油主要成分相對含量的比較Table 2 Comparision of chemical composition of the essential oil from different regions of R.officinalis

從表2可以看出，不同產地的迷迭香精油的相對含量存在較大差異，江西、河南、貴州、山東、廣西產地的迷迭香精油中均有α-蒎烯、莰烯、β-蒎烯、1,8-桉葉素、芳樟醇和樟腦等物質。其中江西產迷迭香精油中的α-蒎烯和芳樟醇的相對含量高于國內其他產地，1,8-桉葉素、β-蒎烯、乙酸龍腦酯和β-石竹烯的相對含量較高；河南產迷迭香精油中莰烯的相對含量最高，貴州產迷迭香精油中β-石竹烯含量最高，山東產迷迭香精油中1,8-桉葉素、樟腦、龍腦含量最高，廣西產迷迭香精油中β-蒎烯、乙酸龍腦酯含量最高。Verma等[19]采用GC-FID和GC-MS技術分析印度北部亞熱帶地區不同生長階段的迷迭香精油，發現不同生長階段其主要成分相同，均為樟腦(23.9%～33.2%)、桉葉油素(20.4%～23.9%)、α-蒎烯(8.5%～14.4%)，但其相對含量存在明顯差異。研究表明，精油成分受植物生長地、土壤、提取方法、植物品種等諸多因素的影響[20]。

2.2 迷迭香精油抗氧化活性的測定結果

2.2.1 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基有個單電子，其乙醇溶液呈深紫色，在517 nm處有強吸收。抗氧化劑的存在可以使得DPPH溶液的顏色從深紫色變為淡黃色，從而具有清除DPPH自由基的能力[21]；褪色越明顯表明抗氧化能力越強。

如圖2所示，不同濃度的迷迭香精油對DPPH自由基清除能力呈現明顯的量效應關系，隨著樣品濃度的增大，對DPPH自由基的清除效果增強；迷迭香精油對DPPH自由基的IC50值為76.42 μL/mL，表明迷迭香精油對DPPH自由基有較好的清除活性。

圖2 迷迭香精油的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging rate of the essential oil from R.officinalis

2.2.2 羥基自由基清除能力的測定

Fe2+和H2O2混合后反應產生高活性的羥基自由基，然后由體系中的水楊酸-乙醇捕捉羥基自由基產生有色物質且在510 nm處有吸收。如果在反應體系中加入有清除羥自由基能力的物質，與水楊酸競爭羥自由基，會使有色物質生成量減少并降低吸光值。

如圖3，不同濃度的迷迭香精油對羥基自由基清除能力呈現較好的量效應關系，隨著樣品濃度的增大，對羥基自由基的清除效果增強；迷迭香精油對羥基自由基的IC50值為51.40 μL/mL，表明對羥基自由基有較好的清除效果。

圖3 迷迭香精油的羥基自由基清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging rate of the essential oil from R.officinalis

2.2.3 還原能力的測定

多數情況下，多數非酶類抗氧化劑的活性都是通過還原反應終止氧化鏈式反應的，化合物的還原能力是顯示其是否具有抗氧化潛能的一個至關重要的因素。吸光值越大，物質的還原力越強，其抗氧化活性也越高。

如圖4，還原力與質量濃度具有一定的量效關系，隨著樣品濃度的增大，還原力增強；迷迭香精油具有較強的還原力，IC50值為49.15 μL/mL。

圖4 迷迭香精油的還原力Fig.4 The reducing power of the essential oil from R.officinalis

2.3 迷迭香精油抑菌試驗結果

2.3.1 抑菌活性的測定

采用濾紙片法測定了迷迭香精油的抑菌圈直徑，結果如表3所示，迷迭香精油對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有良好的抑制作用，其中對枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑為14.40±0.66 mm，抑制作用最強，對大腸桿菌的抑菌圈直徑為11.70±0.27 mm，對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為11.41±0.19 mm，抑菌作用稍弱。

表3 迷迭香精油抑菌圈直徑Table 3 The antimicrobial diameter of the essential oil from

2.3.2 最低抑菌濃度(MIC)的測定

采用微量稀釋法與刃天青顯色法測定了迷迭香揮發油的MIC，MIC值是測定抗菌物質抗菌活性大小的一個指標。結果如表4所示，迷迭香精油對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為2.50、10.00、10.00 μL/mL。從實驗結果可知，迷迭香精油對枯草芽孢桿菌的抑制效果最強，明顯優于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果。這一點與抑菌圈直徑的實驗結果一致。

表4 迷迭香精油的最低抑菌濃度Table 4 MIC of the essential oil from R.officinalis

3 討論與結論

采用水蒸氣蒸餾法結合氣相色譜-質譜連用法(GC-MS)鑒定了迷迭香精油的化學成分，迷迭香精油中含量較高的成分為α-蒎烯(39.05%)和1,8-桉葉素(16.86%)，其次是莰烯(4.22%)、D-檸檬烯(3.87%)、龍腦(3.74%)、β-石竹烯(3.11%)、香葉醇(2.92%)、β-蒎烯(2.23%)、樟腦(2.16%)等，根據ISO國際標準，江西迷迭香精油屬于西班牙型。迷迭香是西餐中經常使用的香料，其特征是具有龍腦、龍腦酯、樟腦等成分的混合香氣[22]，同時具有清甜帶松木香的氣味和風味，香味濃郁[23]。推測這可能與迷迭香中的4種主要成分α-蒎烯、1,8-桉葉素、龍腦、樟腦有關，這4種成分的相對含量占總成分含量的61.80%。其中樟腦具有濃郁的辛香，1,8-桉葉素與莰烯具有類似樟腦香氣，龍腦味辛苦，微寒；有樟腦和松木香氣，α-蒎烯有松木、針葉及樹脂樣的氣息，因此迷迭香呈現出濃郁的松木香氣味。