生姜中6個姜辣素類成分的抗菌活性研究

黎曉菊，庹呈杰，黃之鐠，張曉梅，趙 慶

云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，昆明 650500

抗生素的過度使用導(dǎo)致了越來越嚴重的病原微生物耐藥性問題。細菌的耐藥性一旦產(chǎn)生，不但可通過基因傳遞給子代，而且還可以通過細菌結(jié)合的方式將耐藥性傳遞給其他細菌[1]。有專家擔憂，耐藥性可能成為全球性災(zāi)難，且沒有緩解的跡象[2]。開發(fā)新型的抗菌藥物是全世界所共同面臨的緊迫任務(wù)，從植物藥中尋找抗菌成分是抗菌藥物研發(fā)的一個重要方向。姜科植物是抗菌成分的重要來源之一，近十余年來，已從姜科植物中發(fā)現(xiàn)多個具有優(yōu)良抗菌活性的化學(xué)成分[3-6]。

生姜(ZingiberofficinaleRoscoe)是傳統(tǒng)的食藥同源植物，為姜科姜屬植物[7]。生姜具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、促進消化、改善血液循環(huán)、健胃止痛等藥理作用[8-10]。姜辣素類是生姜中辣味成分，也是生姜中主要活性成分。姜辣素類成分因具有抗腫瘤[11-14]、抗菌[15-18]等生物活性而受到關(guān)注。[6]-姜酚和[6]-姜烯酚對外排型MRSA菌株SA1199B(NorA)、XU212(TetK)和RN4220(MSRA)具有良好的廣譜抗菌活性，并且對R-質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移具有較強抑制作用[15]。Lee等[18]研究發(fā)現(xiàn)[6]-姜酚、[8]-姜酚和[6]-姜烯酚能抑制白色念珠菌生物膜的形成，但與他們結(jié)構(gòu)相似的[10]-姜酚、[8]-姜烯酚和[10]-姜烯酚在濃度為100 μg/mL時未顯示抑制活性。雖然有學(xué)者推測姜辣素類成分的鏈長縮短可能導(dǎo)致抗菌活性降低[15]，但從Lee[18]的研究結(jié)果來看，姜酚與姜烯酚的碳鏈延長似乎導(dǎo)致抗白色念珠菌的活性降低。

本課題組發(fā)現(xiàn)生姜提取物對二十余種病原菌具有明顯的抗菌活性，且提取物經(jīng)光化學(xué)反應(yīng)后抗菌活性明顯增強[19]。本課題組在研究生姜抗菌活性成分的過程中分離得到了6個姜辣素類成分，為了進一步探究該類成分的抗菌活性與脂肪鏈長度的關(guān)系，我們開展了這6個姜辣素類成分對15個病原菌株的抗菌活性研究，以期尋找其中的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 藥材與菌種

市售的云南羅平生姜經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)馬偉光教授鑒定。標本(標本編號：ZO-LP-202103)保存于云南中醫(yī)藥大學(xué)實用中藥學(xué)重點學(xué)科中藥水提工藝實驗室。生姜洗凈、切成薄片，晾干，粉碎后備用。

革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 29213)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633)、肺炎鏈球菌(StreptococcuspneumoniaeATCC 49619)、糞腸球菌(EnterococcusfaecalisATCC 29212)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)：1505、2024、1957、1591、28299、I-20。革蘭氏陰性菌：流感嗜血桿菌(HaemophilusinfluenzaeATCC 49247)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 25922)、鮑曼不動桿菌(AcinetobacterbaumanniiATCC 19606)、克雷伯氏菌(KlebsiellapneumoniaeATCC 13883)、銅綠假單胞菌(PseudomonasAeruginosaPAO1)。以上供試菌株均由課題組前期研究保存。

培養(yǎng)基：病原細菌培養(yǎng)基LB：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂15 g，水定容至1 L，pH7.2～7.6。

1.2 儀器與試劑

儀器：打粉機、研缽、超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；Precisa電子天平；OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；ES-315高壓蒸汽滅菌鍋(TOMY公司)；恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(AIRTECH公司)；培養(yǎng)基配料等常用試劑、耗材均購自雅云生物科技有限公司。核磁共振氫譜、碳譜由Bruker AM-500超導(dǎo)核磁共振儀測定。柱色譜硅膠(300～400目，青島海洋化工廠)。薄層色譜硅膠G板(青島海洋化工廠)，薄層顯色的常規(guī)方法為：5%硫酸-乙醇溶液在150 ℃下烘烤至顯色明顯。

有機溶劑：丙酮、乙酸乙酯、石油醚等均為分析純。

1.3 提取、分離及鑒定

取粉碎的生姜1.0 kg，按料液比1∶3加入甲醇∶丙酮(1∶1，V/V)浸泡7日，超聲2 h，過濾。殘渣再用甲醇∶丙酮(1∶1，V/V)超聲提取2次。合并提取液，濃縮得浸膏90 g。

取15 g浸膏以500 mL氯仿溶解，用600 mL 2.5%氫氧化鈉水溶液萃取。水層用氯仿萃取兩次(每次250 mL)。水層滴加10%鹽酸至中性，用700 mL乙酸乙酯萃取；水層再用200 mL乙酸乙酯萃取。合并乙酸乙酯萃取液，水洗至中性，減壓濃縮得酸性浸膏1.183 g。上述酸性浸膏以硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(10∶1、5∶1、2∶1、1∶2，V/V)梯度洗脫，得到8個餾分(Fr.1～8)。Fr.1經(jīng)ODS柱色譜分離，甲醇-水(25%→85%)梯度洗脫，得到化合物1(44.1 mg)、2(45.5 mg)、3(21.7 mg)。

取75 g浸膏以硅膠柱分離，石油醚-乙酸乙酯(1∶0、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、0∶1，V/V)梯度洗脫，得到9個餾分(Fr.1～9)。Fr.7經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯(3∶1、2∶1、1∶1，V/V)梯度洗脫，再經(jīng)ODS柱色譜分離，甲醇-水(25%→90%)梯度洗脫，得到化合物4(549.6 mg)、5(72.6 mg)、6(110.0 mg)。

采用1H NMR、13C NMR、DEPT及ESI(+)-MS波譜法，并參照文獻數(shù)據(jù)，對上述6個化合物進行鑒定。

1.4 生姜化合物抗菌活性測定

精密稱定化合物1(9.000 0 mg)，以相等的摩爾數(shù)精密稱定化合物2(9.862 4 mg)、3(10.725 4 mg)、4(9.061 1 mg)、5(9.924 0 mg)、6(10.787 0 mg)。分別加入600 μL甲醇溶解至摩爾濃度為0.051 3 mol/L。

病原菌接種至LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 rpm黑暗培養(yǎng)12 h。用液體培養(yǎng)基將各菌液分別稀釋至1×106～1×107CFU/mL備用。采用抗菌紙片擴散法，對6個化合物進行抗菌活性測試。

將稀釋后的指示菌菌液均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，分別取溶解完全的6個化合物10 μL溶液于直徑6 mm的圓形濾紙片上，直至濾紙片將提取液完全吸收后貼于接種好指示菌的固體培養(yǎng)基上，每個化合物做3組平行實驗。以10 μL甲醇做空白對照，以抗生素做陽性對照(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌以芐基青霉素為陽性對照，MRSA以萬古霉素為陽性對照，革蘭氏陰性菌以卡那霉素為陽性對照，每個濾紙片上的抗生素質(zhì)量為50 μg)。病原細菌于37 ℃培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)12 h后測量抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的鑒定

化合物1無色油狀;分子式C17H24O4；ESI-MS：m/z315 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.82(1H，m，H-5′)，6.68(2H，m，H-2′，6′)，5.51(1H，s，H-4)，3.86(3H，m，OCH3)，2.84(2H，m，H-1)，2.56(2H，t，J=8.1 Hz，H-2)，2.25(2H，t，J=7.8 Hz，H-6)，1.57(2H，m，H-7)，1.29(4H，m，H-8，9)，0.88(3H，m，H-10)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：194.4(C-5)，193.5(C-3)，146.4(C-3′)，143.9(C-4)，132.7(C-1′)，120.8(C-6′)，114.3(C-5′)，111.0(C-2′)，99.5(C-4)，55.9(OCH3)，40.6(C-2)，38.3(C-6)，31.4(C-8)，31.4(C-1)，25.5(C-7)，22.4(C-9)，14.0(C-10)。上述數(shù)據(jù)與文獻[20]報道已知化合物一致，鑒定為5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-4-decen-3-one(結(jié)構(gòu)見圖1)。

圖1 化合物1～6的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of compounds 1-6

化合物2無色油狀;分子式C19H28O4；ESI-MS：m/z343 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.82(1H，dd，J=8.1,4.9 Hz，H-5′)，6.68(2H，m，H-2′，6′)，5.50(1H，s，H-4)，3.86(3H，m，OCH3)，2.84(2H，m，H-1)，2.56(2H，t，J=8.3 Hz，H-2)，2.25(2H，t，J=7.6 Hz，H-6)，1.57(2H，m，H-7)，1.28(8H，m，H-8，9，10，11)，0.87(3H，m，H-12)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：194.4(C-5)，193.6(C-3)，146.4(C-3′)，143.9(C-4′)，132.7(C-1′)，120.8(C-6′)，114.3(C-5′)，111.0(C-2′)，99.5(C-4)，55.9(OCH3)，40.6(C-2)，38.3(C-6)，31.7(C-10)，31.6(C-1)，29.2(C-9)，29.0(C-8)，25.8(C-7)，22.7(C-11)，14.0(C-12)。上述數(shù)據(jù)與文獻[20]報道已知化合物一致，鑒定為5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-4-dodecen-3-one。

化合物3白色固體;分子式C21H32O4；ESI-MS：m/z371 [M+Na]；+1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.82(1H，dd，J=8.1,5.1 Hz，H-5′)，6.68(2H，m，H-2′，6′)，5.40(1H，d，J=14.2 Hz，H-4)，3.87(3H，d，J=5.2 Hz，OCH3)，2.84(2H，m，H-1)，2.56(2H，t，J=8.4 Hz，H-2)，2.25(2H，t，J=7.5 Hz，H-6)，1.57(2H，s，H-7)，1.26(12H，m，H-8，9，10，11，12，13)，0.87(3H，t，J=7.0 Hz，H-12)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：194.4(C-5)，193.6(C-3)，146.4(C-3′)，143.9(C-4′)，132.7(C-1′)，120.8(C-6′)，114.3(C-5′)，110.9(C-2′)，99.5(C-4)，55.9(OCH3)，40.6(C-2)，38.3(C-6)，31.9(C-12)，31.4(C-1)，29.5(C-11)，29.4(C-10)，29.3(C-9)，29.2(C-8)，25.8(C-7)，22.7(C-13)，14.2(C-14)。上述數(shù)據(jù)與文獻[20]報道已知化合物一致，鑒定為5-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-4-tetradecane-3-one。

化合物4白色固體;分子式C17H26O4；ESI-MS：m/z317 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：6.81(1H，d，J=1.9 Hz，H-5′)，6.70(1H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′)，6.63(1H，dd，J=2.0，8.0 Hz，H-6′)，3.99(1H，m，H-5)，3.86(3H，s，OCH3)，2.75(4H，m，H-1，2)，2.51(2H，m，H-4)，1.22-1.40(8H，m，H-6，7，8，9)，0.87(3H，m，H-10)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：210.0(C-3)，148.1(C-3′)，145.6(C-4′)，133.6(C-1′)，121.4(C-6′)，115.6(C-5′)，112.6(C-2′)，68.3(C-5)，56.1(OCH3)，50.9(C-4)，45.9(C-2)，38.1(C-6)，32.5(C-1)，25.9(C-8)，23.3(C-9)，14.3(C-10)。上述數(shù)據(jù)與文獻[21]報道的已知化合物一致，鑒定為[6]-姜酚。

化合物5無色油狀;分子式C19H30O4；ESI-MS：m/z345 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.82(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.66(2H，m，H-2′，6′)，4.02(1H，br s，H-5)，3.86(3H，s，OCH3)，2.83(2H，m，H-1)，2.73(2H，m，H-2，)2.48～2.55(2H，m，H-4)，1.33(12H，m，H-6，7，8，9，10，11)，0.87(3H，m，H-12)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：211.6(C-3)，146.4(C-3′)，143.9(C-4′)，132.7(C-1′)，120.7(C-6′)，114.4(C-5′)，110.9(C-2′)，67.7(C-5)，55.9(OCH3)，49.4(C-4)，45.5(C-2)，36.4(C-6)，31.8(C-1)，29.6(C-7)，29.3(C-8)，29.3(C-9)，25.5(C-10)，22.7(C-11)，14.1(C-12)。上述數(shù)據(jù)與文獻[21]報道的已知化合物一致，鑒定為[8]-姜酚。

化合物6白色固體;分子式C21H34O4；ESI-MS：m/z373 [M+Na]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.82(1H，d，J=8.0 Hz，H-5′)，6.66(2H，m，H-2′，6′)，4.02(1H，br s，H-5)，3.83(3H，s，OCH3)，2.83(2H，t，J=7.4 Hz，H-1)，2.73(2H，t，J=7.7 Hz，H-2，)2.48～2.55(2H，m，H-4)，1.33(16H，m，H-6，7，8，9，10，11，12，13)，0.87(3H，t，J=6.9 Hz，H-14)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：211.6(C-3)，146.4(C-3′)，143.9(C-4′)，132.7(C-1′)，120.7(C-6′)，114.4(C-5′)，110.9(C-2′)，67.6(C-5)，55.9(OCH3)，49.3(C-4)，45.5(C-2)，36.4(C-6)，31.9(C-1)，29.6(C-7)，29.6(C-8)，29.6(C-9)，29.3(C-10)，29.3(C-11)，25.5(C-12)，22.7(C-13)，14.1(C-14)。上述數(shù)據(jù)與文獻[21]報道的已知化合物一致，鑒定為[10]-姜酚。

2.2 生姜化學(xué)成分的抗菌活性測定

采用紙片擴散法[22]，對化合物1～6進抗菌活性測試，共采用了15株病原菌，結(jié)果見表1。測試結(jié)果表明：與姜酚型化合物4、5、6相比，烯醇型化合物1、2、3對更多的革蘭氏陽性菌具有抑制活性。姜酚型化合物4和5對四種革蘭氏陰性菌具有抗菌活性，僅對銅綠假單胞菌無抗菌活性。烯醇型化合物只有化合物1對五種革蘭氏陰性菌都具有抗菌活性。就烯醇型化合物而言，化合物1對絕大多數(shù)菌株的抗菌活性大于化合物2和3。就姜酚型化合物而言，化合物4的抗菌活性大于化合物5，而化合物6對所有15種菌株均無抗菌活性。上述6個化合物的脂肪鏈長順序為：1<2<3；4<5<6。由此初步推測：脂肪鏈的長度增加，將導(dǎo)致抗菌活性降低。

表1 化合物1～6的抑菌圈直徑Table 1 Diameter of inhibition zone of compound 1-6

續(xù)表1(Continued Tab.1)

3 討論與結(jié)論

我們從生姜中分離鑒定了6個姜辣素類成分，并對這6個化合物進行抗菌活性測試，在此基礎(chǔ)上對構(gòu)效關(guān)系進行初步探討。總的來說，與姜酚型化合物4、5、6相比，烯醇型化合物1、2、3對更多的革蘭氏陽性菌具有抑制活性；姜酚型化合物4和5對革蘭氏陰性菌的抗菌活性優(yōu)于烯醇型化合物。根據(jù)我們的抗菌測試數(shù)據(jù)，并結(jié)合Lee等[18]的研究結(jié)果來看，姜辣素類成分脂肪鏈的長度增加，可能導(dǎo)致抗菌活性降低。我們和Lee等[18]的抗菌活性測試都只是針對脂肪鏈長為5、7、9個碳原子的姜辣素類成分；至于碳原子數(shù)少于5個或多于9個的脂肪鏈，上述規(guī)律是否還適用，尚需要進一步探討。

姜辣素類成分是生姜中的一類重要的抗菌成分，從此類成分中挖掘有苗頭的抗菌活性成分或先導(dǎo)化合物是值得進一步探索的。本項研究可以為具有抗菌活性的姜辣素類成分研究與開發(fā)及其抗菌機制研究打下基礎(chǔ)。