外泌體miR-9-3p在非小細胞肺癌血清中表達及檢測的臨床意義

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌病例總數的80%以上

。早期診斷可顯著改善預后，但大多數患者在首次診斷時已進展到中晚期，5年生存率相對較差

。因此尋找對NSCLC患者進行早期篩查和診斷方法一直是醫學界研究的熱點。目前肺癌的早期篩查主要依靠低劑量螺旋CT

，確診的金標準為腫瘤組織活檢病理組織學檢查

，但低劑量螺旋CT對早期肺癌漏診率較高，活檢病理組織學作為有創檢查不適合早期診斷；近年來常規腫瘤標志物檢測一度作為早期肺癌篩查指標，但敏感性、特異性不盡如人意。

miRNA是內源性非編碼小分子RNA，可用于調節細胞的增殖、分化和凋亡

。外泌體是納米級囊泡，直徑為30～100 nm，幾乎所有類型的細胞都可分泌

。外泌體是miRNA運輸的主要載體之一，可以存在于尿液、唾液、血漿或惡性分泌物中

。近年來，研究發現

miRNA在腫瘤的診斷、預后和治療中發揮重要的作用，miRNA可能成為NSCLC的新型腫瘤標志物。miR-9-3p是新發現的miRNA之一，在肝癌、胃癌、膠質瘤患者中的表達明顯下調

。在本研究中，對NSCLC患者和肺部良性病變受試者血清外泌體中miR-9-3p的表達進行了比較和分析，并討論了NSCLC 血清外泌體中miR-9-3p聯合癌胚抗原(CEA)、細胞角蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)檢測診斷NSCLC的價值。

1 臨床材料與方法

1.1 臨 床 材 料 收 集2016 年1 月 至2017 年12 月在青島大學附屬醫院經組織病理學確診的80例NSCLC患者為研究對象。男42例，女38例；年齡39 ～82 歲，平 均 年 齡(52.63±13.18)歲；臨 床 分期：Ⅰ期10例、Ⅱ期30例、Ⅲ期32例、Ⅳ期8例；組織學分類：肺腺癌44例、肺鱗癌36例。良性對照組50例包括肺結核、肺膿腫、良性肺結節等，男26 例，女24 例；年 齡38 ～79 歲，平 均 年 齡(53.64±14.32)歲。兩組患者性別、年齡等基線資料比較差異無統計學意義(

＞0.05)，具有可比性。該研究取得醫院倫理委員會的批準(醫院倫理批準文號：Qdlyy201512097)，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 選取標準 納入標準：所有入選病例均經病理組織學確診為NSCLC；均為原發性肺癌；血清樣本收集之前，患者沒有接受過化療、放療或其他抗腫瘤治療；均有血清外泌體miR-9-3p、CEA、CYFRA21-1檢查資料；研究所需資料齊全。排除標準：排除轉移性肺癌；排除伴有其他部位惡性腫瘤者；排除嚴重肝、心、腎功能不全者。

1.3 方法 受試者清晨空腹時采集外周靜脈血約5 mL，以1 500 g離心10 min，隨后取上清在4 ℃下12 000 g離心10 min。2 h內用一份血清樣本檢測腫瘤標志物CEA、CYFRA21-1水平，第二份置于－80 ℃冰箱保存，直到提取總RNA。

本研究就女性免疫性不孕與慢性生殖道炎癥及微量元素的關系進行探究與分析，結果顯示，免疫性不孕的女性患者其陰道分泌物炎性因子(IL-6、IL-8及TNF-α)及血清銅均高于健康正常孕婦，血清硒及鋅均低于健康正常孕婦，且不同分類與病程免疫性不孕者的陰道分泌物炎性因子及血清微量元素指標差異有統計學意義，Logistic分析顯示，上述檢測指標均與女性免疫性不孕有密切關系，進而肯定了上述指標與女性免疫性不孕的關系。其中慢性生殖道炎癥導致的炎性細胞因子表達增強可較大程度反映生殖道的炎性損傷，微量元素對于子宮內膜及生殖系統其他方面的影響也較大程度存在，且對免疫的失調影響較大[17-19]。

提取外泌體之前需在室溫下將血清樣本進行解凍，隨后取上清300 μL，加入外泌體提取試劑60 μL(美國Invitrogen

總外泌體分離試劑盒，貨號4480025)，在4 ℃孵育30 min，然后室溫下以12 000 g離心10 min，最后使用100 μL PBS緩沖液重懸沉淀，得到血清外泌體。使用miRcute miRNA提取分離試劑盒(中國天根科技生化有限公司)從外泌體中提取miRNA。通過加尾法，使用Mir-X miRNA First-Strand合成試劑盒 (TaKaRa中國) 將提取的miRNA 逆轉錄為cDNA。采用TB-Green Premix ExTaq Ⅱ (TaKaRa中國) 試劑進行實時熒光定量PCR檢測。使用U6基因作為內參基因，采用2

法計算miR-9-3p表達的相對定量。所有實驗均重復3次。

混合裝配生產線是指在一條生產線上，通過改變裝配零部件的型號來生產不同種類的產品[1]。混裝生產線一方面由于每個工位裝配零部件的不同加大了工人操作的難度與強度；另一方面經常在流水線更換產品時發生錯裝、漏裝等問題。而防錯系統可以有效地減小上述錯誤的發生，提高產品的合格率[2]。

1.4 統計學方法 使用Graphpad Prism 8軟件和SPSS 25.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料使用

檢驗，不符合正態分布的計量資料使用Mann-Whitney

檢驗；計數資料采用卡方檢驗；Spearman相關分析；通過繪制ROC曲線求取miR-9-3p診斷NSCLC的最佳臨界值；以病理診斷為金標準，用四格表法統計計算miR-9-3p、CEA、CYFRA21-1單項及聯合檢測診斷NSCLC的價值。

＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

英文作為通用語言，在翻譯成各國的文字時需要遵循每個國家的特點進行翻譯，翻譯時需要結合本國的文化特色，風土人情以及人們的慣用語，這樣翻譯出來的文章才能夠被廣大讀者理解和接受。下面對翻譯方法加以詳細描述。

2.1 兩組受試者血清外泌體miR-9-3p 及CEA、CYFRA21-1表達水平比較 NSCLC組血清外泌體miR-9-3p及CEA、CYFRA21-1表達水平明顯高于良性對照組，差異有高度統計學意義(

＜0.000 1)，見表1。

2.2 NSCLC 血 清 外 泌 體miR-9-3p 與CEA、CYFRA21-1表達水平相關性分析 Spearman相關分析顯示，NSCLC血清外泌體miR-9-3p 表達水平與CEA、CYFRA21-1 表達水平具有明顯正相關(

＝0.936、

＝0.954，

＜0.001、

＜0.001)，

＜0.01。

小流域是河流水系中的基本集水單元，大流域生態治理的規劃與實施，需要以小流域為基本治理單元。把大流域分解成不同層次、不同類型的小流域，這些小流域是一個個相對獨立的生態系統，也是生態環境受到不同程度人為影響的一個個單元。從小流域存在問題出發，遵循正確的生態治理理念和做法，可以把這些小流域從生態環境退化的單元改造成為水—土—氣—生各圈層良性循環、人類與環境和諧共存的單元。小單元的活動可以形成大系統的變化，同樣，一個個小流域的生態修復將最終達成大流域整體生態系統的功能恢復與提升。

2.3 血清外泌體miR-9-3p聯合CEA、CYFRA21-1診斷NSCLC 的價值比較 繪制血清外泌體miR-9-3p 診 斷NSCLC 的ROC 曲 線， 見 圖1，miR-9-3p 診斷NSCLC曲線下面積 (ROC-AUC)為0.738，選取最大約登指數 (0.702) 對應的miR-9-3p 值作為診斷NSCLC 最佳臨界值，為1.827。血清外泌體miR-9-3p、CEA、CYFRA21-1在NSCLC和對照組診斷結果與病理診斷結果對照，見表2。以病理診斷為金標準，血清外泌體miR-9-3p 聯 合CEA、CYFRA21-1 診 斷NSCLC的 價值比較，見表3。三項聯合檢測診斷NSCLC的敏感性、準確性、陰性預測值與各單項檢測比較明顯提高，

＜0.01。

3 討論

腫瘤細胞釋放的外泌體經常攜帶蛋白質、脂質和核酸，在局部和遠處的受體細胞之間交換必要的信息

。由于外泌體可以在體液中很容易被獲得，可以作為腫瘤“液體活檢”潛在的生物標志物

。外泌體攜帶血液循環中的miRNA，其磷脂膜可以保護最上層的核糖核酸，不被核糖核酸酶降解，miRNA在外泌體中非常穩定

。miRNA是一類長度約為22個核苷酸的內源性、短單鏈非編碼的RNA分子，與腫瘤進展、細胞分化、細胞凋亡或細胞信號傳導密切相關，對真核生物基因轉錄后調控具有重要作用

。miRNA表達譜已被用于腫瘤診斷、分期和預測預后

。

許多研究表明，miR-9 在腫瘤中表達異常。miR-9在胰腺癌、肝癌以及鼻咽癌中抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲

。在膠質瘤患者中，miR-9-3p通過靶向FOXG1抑制膠質瘤細胞的增殖和凋亡

。從骨髓間充質干細胞提取的外泌體miR-9通過下調內皮細胞特異性分子-1的表達抑制膀胱癌的進展

。miR-9在卵巢癌中表達上調可以降低E- 鈣粘蛋白的表達從而促進腫瘤轉移

。在本研究中，我們重點研究了miR-9-3p在NSCLC中的表達，結果表明與對照組相比，NSCLC患者中miR-9-3p的表達顯著上調，表明miR-9-3p可能是NSCLC診斷的潛在生物標志物。本研究還做了NSCLC患者中miR-9-3p與常規標志物CEA、CYFRA21-1血清水平相關性分析，結果顯示miR-9-3p表達水平與CEA、CYFRA21-1表達水平具有明顯正相關性；血清miR-9-3p、CEA、CYFRA21-1三項聯合檢測診斷NSCLC的敏感性、準確性、陰性預測值與各單項檢測比較明顯提高，有利于臨床早期診斷，減少誤漏診。

外泌體作為新一代診斷標志物，具有諸多優點，為多種疾病的診斷開辟了新的思路。本研究筆者只探討了外泌體miR-9-3p在NSCLC血清中的表達水平，及聯合常規標志物診斷NSCLC的價值，在后續工作中還要進一步深入研究血清miR-9-3p與不同臨床病理因素(腫瘤大小、組織類型、臨床分期、復發轉移及預后)相關性，為NSCLC的診療提供依據。

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