麩金櫻子中沒食子酸的提取工藝優(yōu)化

余中霞，李振興，何亞芬，方文超，黃道明

1.上饒市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證院，江西 上饒 334000；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006

金櫻子為薔薇科植物金櫻子Rosa laevigata Michx的干燥成熟果實(shí)，別名糖罐、山雞頭子、金罌子。10～11 月果實(shí)成熟變紅時(shí)采收；干燥，除去毛刺。具有固精縮尿、固崩止帶、澀腸止瀉的作用［1］。分布于江西、福建、安徽、江蘇、貴州、臺(tái)灣、湖南等地，在江西分布廣泛，主要在九江、樟樹、新余、南昌、上饒等地。金櫻子的藥用價(jià)值高，近年國(guó)內(nèi)對(duì)金櫻子成分和藥理活性成分的研究成果不斷涌現(xiàn)，果肉中有效成分包括黃酮、多糖、酚酸、三萜類等，三萜類具有抗阿爾茨海默病作用［2］，總多酚有降脂作用［3］，多糖具抗氧化活性［4］，有研究表明金櫻子、牛磺酸、枳椇子聯(lián)合用藥對(duì)小鼠酒精性肝損傷有保護(hù)作用［5］。沒食子酸為金櫻子總酚酸的主要成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒等多種生物活性，可為神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病、肝纖維化、糖尿病和腫瘤等的輔助治療［6-8］。但對(duì)于麩制金櫻子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)優(yōu)選麩金櫻子的提取工藝，為麩金櫻子的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（配DAD 檢測(cè)器，沃特斯科技上海有限公司）；DZKW-S-C 電熱恒溫水浴鍋；Sartorius MSE125P-1CE-DU 型 電 子天 平；普力菲爾FST-IV-10 型超純水機(jī)。

1.2 試藥

麩金櫻子飲片，用金櫻子藥材（由江西瑞康堂中藥飲片有限公司提供，經(jīng)上饒市檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證院副主任藥師黃道明鑒定為正品）麩炒；沒食子酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110831-201906,純度：91.5 %）；乙腈和甲醇均為HPLC 級(jí)（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），乙醇、磷酸為分析純，超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制工藝

取金櫻子肉100 g,加麥麩10 g，160 ℃炒制3 min［9］，取出，篩去麥麩。

2.2 供試品溶液中沒食子酸含量的測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Cyan-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸溶液-乙腈（97∶3）；檢測(cè)波長(zhǎng)：272 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：28 ℃。

2.2.2 溶液的制備 （1）沒食子酸對(duì)照品溶液的配制：精密稱取沒食子酸對(duì)照品10.87 mg，置50 mL 量瓶中，加70%甲醇超聲使沒食子酸溶解，定容，搖勻，沒食子酸對(duì)照品溶液的濃度為0.198 9 mg/mL(按純度折算)，過濾，即得。（2）供試品溶液的配制：取按“2.1”方法麩制的金櫻子飲片，粉碎，過4 號(hào)篩，精密稱取0.5 g，置圓底燒瓶中，加70%甲醇50 mL，稱重，置75 ℃水浴30 min，取出，放冷，補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)［10-13］，以水浴溫度（A）、甲醇濃度（B）和提取時(shí)間（C）為三因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以沒食子酸含量為評(píng)價(jià)性指標(biāo)，優(yōu)選出對(duì)沒食子酸提取顯著的因素，正交設(shè)計(jì)因素水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及沒食子酸含量測(cè)定結(jié)果見表2，正交試驗(yàn)方差分析表3。由表2和表3 可見，水浴溫度（A）和甲醇濃度（B）對(duì)提取結(jié)果有顯著影響，即A＞B＞C（水浴溫度＞甲醇濃度＞提取時(shí)間），最佳工藝為A2B2C1，即以70%的甲醇為提取溶劑，75 ℃水浴回流30 min。

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與沒食子酸含量結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 取麩金櫻子飲片，粉碎，過4 號(hào)篩，按最佳工藝進(jìn)行提取，平行操作3 次，結(jié)果沒食子酸的含量分別為265.43、263.89、264.11 μg/g，平均為264.48 μg/g，RSD 為0.31%，表明該提取工藝穩(wěn)定可靠。

2.2.5 方法學(xué)考察 （1）系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取“2.2.2”項(xiàng)下的溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μL，記錄色譜圖。結(jié)果，供試品溶液色譜圖在與對(duì)照品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上有相同的色譜峰。沒食子酸峰與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按沒食子酸計(jì)不低于3 000。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖：A.對(duì)照品溶液，B.供試品溶液

（2）線性關(guān)系考察：精密量取“2.2.2 ”項(xiàng)下沒食子酸對(duì)照品溶液0.25 mL，0.50 mL，1.0 mL，2.0 mL，3.0 mL 分別置10 mL 容量瓶中，用70%甲醇稀釋，定容，搖勻，過濾，測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲 線。得回歸方程Y=3×10-5X-0.007 5，r=0.999 3，沒食子酸在0.497 5 μg/mL～5.970 0 μg/mL 范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。

（3）精密度試驗(yàn)：取“2.2.2 ”項(xiàng)下沒食子酸對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄主峰面積，計(jì)算RSD 為0.25%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

（4）重復(fù)性試驗(yàn)：稱取同一批供試品按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份，測(cè)得沒食子酸的峰面積的RSD 為1.42%。結(jié)果顯示方法重復(fù)性良好。

（5）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取“2.2.2”項(xiàng)下的供試品溶液，室溫放置24 h,每隔2 h 測(cè)定一次，沒食子酸RSD為0.45%。表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

（6）加樣回收率試驗(yàn)：取已知含量的供試品，精密稱定6 份，分別精密加入“2.2.2 ”項(xiàng)下沒食子酸對(duì)照品溶液0.4 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定峰面積，計(jì)算，得回收率為93.78%，RSD=1.08%。見表4。

3 討論

經(jīng)高效液相色譜儀的DAD 檢測(cè)器掃描200～400 nm 范圍內(nèi)的光譜圖，結(jié)果沒食子酸在214 nm和272 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收；流動(dòng)相分別比較了不同比例的乙腈-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-水；柱溫比較了室溫、28 ℃、35 ℃；當(dāng)波長(zhǎng)為272 nm，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（97∶3）,柱溫 28 ℃時(shí)主峰與其他雜質(zhì)峰分離度較好，可用于麩金櫻子中沒食子酸含量測(cè)定。

本研究采用正交試驗(yàn)法，研究了多因素、多水平的常用試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法［14］。本次試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示影響因素為水浴溫度＞甲醇濃度＞提取時(shí)間，且水浴溫度和甲醇的濃度對(duì)沒食子酸的提取影響顯著。本次實(shí)驗(yàn)比較了水浴回流和超聲提取，超聲提取不能很好地控制溫度，故采用水浴回流。比較了乙醇和甲醇作為溶劑，甲醇提取液的目標(biāo)物質(zhì)濃度更大，雜質(zhì)更少，故采用不同濃度的甲醇提取，結(jié)果表明70%甲醇提取效果最好。經(jīng)工藝驗(yàn)證，本次研究所制定的提取工藝穩(wěn)定性較好，可操作性強(qiáng)。

目前，《中國(guó)藥典》只有金櫻子多糖的含量測(cè)定，對(duì)其他主要成分未做相關(guān)規(guī)定，且鮮有文獻(xiàn)報(bào)道麩制金櫻子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。本次試驗(yàn)主要通過優(yōu)化麩制后金櫻子中沒食子酸的提取工藝，為麩金櫻子的總酚酸測(cè)定提供參考。