瑤藥祛風活絡噴霧劑質量標準及微生物限度檢查方法研究

邱瓊華，李雋永，韋倩，張新林，毛桂福

柳州市中醫醫院，廣西 柳州 545001

祛風活絡噴霧劑是由四方藤、黃鎖梅根、續斷、鐵包金、五指毛桃、大鉆、雞血藤、石南藤等壯瑤藥組方而成,經55%乙醇滲漉制成的外用制劑，具有通經活絡，消腫止痛等功效。該處方在柳州市中醫醫院使用多年，臨床主要用于風濕痹痛，腰肌勞損。該制劑中原料藥物四方藤［1］在瑤醫學中具有祛風除濕，舒筋通絡的作用，可用于崩閉悶（風濕、類風濕性關節炎），錐碰江悶（坐骨神經痛），改悶（腰痛、腰肌勞損），播沖（跌打損傷）等，是祛風活絡噴霧劑中主要起效的藥味，其指標成分巖白菜素具有鎮痛抗炎的作用［2］；續斷則能強筋骨，續折傷，是骨傷科常用中藥，其活性成分川續斷皂苷Ⅵ在現代藥理學研究中顯示了對骨組織的保護作用，同時也有一定鎮痛作用［3-4］。所以本研究在考慮該制劑質量標準制定時，重點研究了上述兩味藥物的定性與定量的檢驗方法。此外，開展制劑的微生物檢驗方法研究，是保證制劑安全性的前提［5］，故本研究同時對制劑的微生物檢驗方法適用性進行試驗，為祛風活絡噴霧劑的質量檢驗提供依據，也為其他民族制劑的質量標準的制定提供參考。

1 設備與試劑

1.1 設備

1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；AL204 分析天平（德國梅特勒托利多公司）；KQ-800DE 超聲器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP 電子分析天平（德國賽多利斯公司）。ZF-1 型三用紫外分析儀（杭州齊威儀器有限公司）；DNP-9162BS-Ⅲ型電熱恒溫培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）；MJX-100B-Z 型霉菌培養箱（上海博迅醫療生物儀器股份有限公司）；YRH-150 型生化培養箱（上海姚氏儀器設備廠）；XG1.C 型臥式壓力滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司）；VS-1300L-U 型凈化工作臺、BSL-1004 ⅡA2 型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

1.2 試藥

祛風活絡噴霧劑3 批（20220101、20220201、20220202，均由柳州市中醫醫院制劑室生產）；巖白菜素對照品（批號：MUST-21060907，純度99.65%），川續斷皂苷Ⅵ對照品（批號：MUST-21012211，純度98.95%）均購于成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：1105831），胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，批號：1105271），胰酪大豆胨液體培養基（TSB，批號：1101551），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，批號：1105071）等，均購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌的CMCC 號分別是［CMCC（B）26003、CMCC（B）63501、CMCC（B）10 104、CMCC（F）98001、CMCC（F）98003、CMCC（B）44102、CMCC（B）50094］，試驗所用菌株均為第3 代，均購自廣東環凱微生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 四方藤、續斷的定性鑒別

2.1.1 四方藤 取樣品20 mL，加石油醚（60～90 ℃）-乙酸乙酯（2∶1）混合溶液30 mL，振搖，取下層溶液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取巖白菜素對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。同時制備相應的缺四方藤陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗［6］，吸取上述三種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲醇（2∶2.5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%鐵氰化鉀-2%三氯化鐵（1∶1）的混合溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果如圖1，顯示該方法可行且無陰性干擾。

圖1 祛風活絡噴霧劑中四方藤的薄層色譜圖

2.1.2 續斷 取樣品20 mL，用乙醚振搖提取2 次，每次20 mL，棄去乙醚液，再用水飽和的正丁醇提取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，再用氨試液、正丁醇飽和的水各洗滌2 次，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取川續斷皂苷Ⅵ對照品，加甲醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液，作為對照品溶液。同時制備相應的缺續斷的陰性樣品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取上述三種溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結果見圖2，顯示該方法可行且無陰性干擾。

圖2 祛風活絡噴霧劑中續斷的薄層色譜圖

2.2 巖白菜素、川續斷皂苷Ⅵ的含量測定［7-8］

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（見表1）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為212 nm；進樣量10 μL。

表1 祛風活絡噴霧劑含量測定梯度洗脫表

2.2.2 混合對照品溶液的制備 取巖白菜素、川續斷皂苷Ⅵ對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL 分別含巖白菜素51.07 μg、川續斷皂苷Ⅵ207.60 μg 的混合溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取樣品（批號：20220101）5 mL，置25 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 分別制備缺四方藤與缺續斷的陰性樣品，并按“2.2.3”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.5 系統適應性和專屬性試驗 按“2.2.1”項下色譜條件對上述三種溶液進樣測定，結果見圖3。

圖3 HPLC圖：A.混合對照品；B.祛風活絡噴霧劑樣品；C.缺四方藤陰性樣品；D.缺續斷陰性樣品

結果顯示巖白菜素、川續斷皂苷Ⅵ與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且無陰性干擾，表明該方法具有較好的專屬性。

2.2.6 線性關系考察 取巖白菜素對照品配制成質量濃度分別為12.77、25.54、51.07、76.61、102.14、127.68 μg/mL；川續斷皂苷Ⅵ對照品配制成質量濃度分別為51.90、103.80、207.60、311.40、415.19、518.99 μg/mL 的系列混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定。以對照品濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，巖白菜素和川續斷皂苷Ⅵ分別在12.77～127.68 μg/mL 和51.90～518.99 μg/mL 質量濃度范圍內線性關系良好。回歸方程分別為巖白菜素Y=4.11×10X+45.725，r=0.999 7；川續斷皂苷ⅥY=1.75X+0.178，r=0.999 9。

2.2.7 精密度試驗 取同一供試品溶液連續進樣6次，以巖白菜素和川續斷皂苷Ⅵ的峰面積計算，RSD 分別為2.88%、1.58%，說明儀器精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，在0、2、4、6、8、12 h 分別進樣，以巖白菜素、川續斷皂苷Ⅵ的峰面積計算，RSD 分別為2.81%、0.41%，表明供試品溶液在12 h 內穩定。

2.2.9 重復性試驗 取祛風活絡噴霧劑（批號：20220101），按“2.2.3”項下方法制備6 份供試品溶液，進樣測定，結果顯示巖白菜素、川續斷皂苷Ⅵ含量的RSD 分別為1.29%、0.32%，說明該方法具有良好重復性。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密量取祛風活絡噴霧劑（批號：20220101）6 份各2.5 mL，每份分別加入巖白菜素對照品510.71 μg、川續斷皂苷Ⅵ對照品556.98 μg，用50%甲醇定容至25 mL，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算回收率及RSD。詳見表2、表3。結果顯示巖白菜素、川續斷皂苷Ⅵ 的平均加樣回收率分別為100.30%、101.04%，RSD分別為0.77%、0.51%，說明該方法準確度較高。

表2 巖白菜素加樣回收率試驗

表3 川續斷皂苷Ⅵ加樣回收率試驗

2.2.11 樣品的含量測定 取祛風活絡噴霧劑樣品3批，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，結果見表4，巖白菜素和川續斷皂苷的平均含量分別為244.9 μg/mL、789.0 μg/mL，RSD 分別為1.41%、3.56%。

表4 三批祛風活絡噴霧劑的含量測定結果

3 微生物計數方法學試驗

3.1 微生物檢查常規法

3.1.1 菌懸液的制備 按《中國藥典》2020 年版方法，把金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉制成菌落數不大于104cfu/mL的菌懸液。

3.1.2 供試品溶液的制備 以pH 7.0 無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制備1∶10 供試品溶液。試驗組：供試品溶液（9.9 mL）5 份，分別加入“3.1.1”項下5 種菌懸液0.1 mL，混勻，各取1 mL 注皿，平行制備2份。供試品對照組：取供試品溶液（9.9 mL），分別加入試驗組對應的稀釋液0.1 mL，混勻，各取1 mL注皿，平行制備2 份。菌液對照組：分別取“3.1.1”項下5種菌懸液0.1 mL，并用試驗組對應的稀釋液9.9 mL 混勻，各取1 mL 注皿，平行制備2 份。

試驗菌加樣回收測定：上述各組，按藥典方法進行培養。回收比值=（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）/菌液對照組菌落數，其范圍應為0.5～2.0。結果見表5，由結果可知，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌回收比均小于0.5，不滿足加樣回收的要求，表明本樣品1∶10 供試品溶液對需氧菌、酵母菌有一定的抑制作用，需進一步實驗。

表5 常規法試驗菌株回收比（n=3）

3.2 薄膜過濾法

3.2.1 菌懸液的制備 方法同“3.1.1”項，但制備為各菌落數不大于100 cfu/mL 的菌懸液。

3.2.2 供試品溶液的制備 先以pH 7.0 無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成1∶10 供試品溶液；再取1∶10供試品溶液1 mL，用100 mL pH 7.0 無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋，搖勻，備用。試驗組：取混勻的備用供試品溶液進行薄膜過濾，用200 mL pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液分2 次進行沖洗，并在末次沖洗中分別加入“3.2.1”項下各菌懸液1 mL。每種菌株平行制備2 張濾膜，菌面朝上，置于相應的瓊脂平皿中。供試品對照組：取混勻的備用供試品溶液進行薄膜過濾，沖洗方法同上述試驗組，但無須加入菌懸液。菌液對照組：用200 mL pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液分2 次進行沖洗，并在末次沖洗液中分別加入各菌懸液1 mL，各平行制備2份進行培養。

試驗菌加樣回收測定：分別按需氧菌總數以及霉菌和酵母菌總數計數的試驗條件進行培養，并計算加樣回收比值。結果見表6，由結果可知，使用薄膜過濾法消除了制劑的抑菌作用，各菌株的回收比均大于0.5，滿足加樣回收的要求，表明該方法適用于祛風活絡噴霧劑的微生物計數。

表6 薄膜過濾法試驗菌株回收比（n=3）

3.3 控制菌檢查法的適用性試驗

3.3.1 金黃色葡萄球菌 （1）試驗組：取“3.2.2”項下1∶10 供試品溶液3 份各10 mL，分別置于100、200、300 mL 胰酪大豆胨液體培養基（TSB）中，并分別加入“3.2.1”項下含有菌落數不大于100 cfu/mL的金黃色葡萄球菌懸液1 mL，混勻。（2）菌液對照組：以10 mL 稀釋液替代供試品溶液加入不同體積TSB 中，其余操作方法與試驗組相同。（3）供試品組：取“3.2.2”項下1∶10 供試品溶液10 mL，并以稀釋液代替菌懸液，其余操作方法與試驗組相同。（4）稀釋液組：以10 mL 稀釋液代替供試品溶液，不加菌液，其余操作方法與試驗組相同。

3.3.2 銅綠假單胞菌 實驗方法同“3.2.1”，所加菌懸液為菌落數不大于100 cfu/mL 的銅綠假單胞菌按2020 版《中國藥典》（通則1106）規定方法培養并劃線，觀察結果。

結果顯示，以100、200、300 mL TSB 為培養基體積時，試驗組、菌液對照組均檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌，稀釋液組與供試品組則都無菌生長，提示祛風活絡噴霧劑對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌均無抑菌作用，可用常規法進行該控制菌檢查，且TSB 的培養體積為100 mL。

3.4 微生物限度檢查

根據上述試驗的結果，需氧菌、霉菌和酵母菌按薄膜過濾法，控制菌按100 mL TSB 培養體積對祛風活絡噴霧劑的微生物限度進行檢查，結果見表7。三批樣品均符合2020 年版《中國藥典》四部對不含藥材原粉的中藥液體口服制劑及局部給藥制劑的限度要求。

表7 三批樣品微生物限度檢查結果

4 討論

4.1 薄層鑒別研究

由于四方藤與續斷均是祛風活絡噴霧劑組方中的主要藥味，故開展定性鑒別研究。前期預實驗顯示，四方藤的供試品溶液制備時，單獨使用甲醇、乙酸乙酯、石油醚（60～90 ℃）去除雜質，樣品的斑點均出現嚴重拖尾現象，而使用乙酸乙酯-石油醚（60～90 ℃）（1∶2）去除雜質，樣品斑點清晰，無其他干擾。此外，考察了不同溫度（4 ℃、25 ℃），不同濕度（33%、60%、88%）對樣品中四方藤、續斷藥材薄層鑒別的影響，發現溫濕度不影響實驗結果。

4.2 含量測定方法研究

本研究摸索了祛風活絡噴霧劑中指標成分巖白菜素和川續斷皂苷Ⅵ的HPLC 含量測定方法，預實驗對巖白菜素和川續斷皂苷Ⅵ分別在190～400 nm 范圍內進行了紫外掃描，結果巖白菜素在220 nm 和275 nm 處有最大吸收，川續斷皂苷Ⅵ在近紫外端212 nm 下具有較強吸收，且這兩個成分在212 nm處均有較強吸收，故選取212 nm 作為本實驗的吸收波長。其次，因含量測定中兩個待測指標成分極性差異較大［9-10］，故采用梯度洗脫模式達到分離要求。對流動相進行考察時，發現乙腈-0.2%磷酸溶液體系分離效果好，故選擇其為流動相。本實驗還對樣品稀釋溶劑（50%甲醇、70%甲醇、甲醇）進行了考察，發現當使用70%甲醇或甲醇稀釋時，巖白菜素的色譜峰出現分叉，可能由于樣品溶劑與流動相極性相差較大導致；而用50%甲醇稀釋時，巖白菜素色譜峰未出現分叉情況。

4.3 微生物檢驗方法學研究

本研究中祛風活絡噴霧劑為使用乙醇滲漉制備的外用制劑，按非無菌不含藥材原粉的中藥制劑的微生物限度標準檢查。選擇微生物計數方法時，由于常規法具有操作簡單、結果準確、成本較低的優點，故首先采用常規法試驗。結果發現，常規法對需氧菌、酵母菌均有一定的抑制作用，故使用薄膜過濾法消除其抑菌效力，結果顯示各菌株回收比值滿足具體的要求，所以最終選擇薄膜過濾法作為該制劑微生物計數的方法。分析祛風活絡噴霧劑的抑菌作用，其原料藥物當歸［11］、雞血藤［12］、茜草［13-14］、五指毛桃［15］等在現代研究中均顯示了對金黃色葡萄球菌的抑制作用；千斤拔［16］則被發現對白色念珠菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌及金黃色葡萄球菌等致病菌均有抑制作用；黑老虎［17］對枯草芽孢桿菌有一定抑制作用，推測祛風活絡噴霧劑提取工藝可以提出原料藥物的主要抑菌成分，使該制劑有一定的抑菌作用。

瑤醫藥是中華民族傳統醫藥的一部分，在治療風濕、類風濕等疾病方面有自己獨特的優勢，本研究中的祛風活絡噴霧劑處方在臨床使用三十多年，組方亦體現了瑤醫學“風打”結合的特征，臨床運用患者均反饋良好。本研究為該制劑的質量標準制定提供了依據，可用于該制劑的日常檢驗。