O2/CO2主動自發氣調對采后松露貯藏品質及微觀結構的影響

蔣方國

胡海洋1

龔曉源1

劉 杰2

李 翔1

(1. 成都大學食品與生物工程學院, 四川 成都 610106；2. 重慶建設汽車系統股份有限公司，重慶 400054)

松露是塊菌屬真菌的子囊果，在土壤或落葉層中與植物根系共生，富含蛋白質、維生素、脂肪酸等營養物質[1]，并含有具有緩解疲勞、抑制癌細胞、調節女性生理周期等功能的多糖、α-雄烷醇及甾醇類等多種生理活性物質[2-4]。由于其獨特且濃郁的香氣備受消費者青睞，歐洲人將其盛贊為“王公貴族之珍饈”[5]。然而，短暫的采收期和保質期限制了其市場的向外擴張[6]。松露采后會因機械損傷、環境脅迫、微生物浸染導致的呼吸作用加劇而極易腐敗變質，其腐敗產生的乳酸和乙醇雖然可以保護松露免受表面霉菌和細菌的侵害，但有香氣變化的潛在風險[7]。目前國內外多采用氣調、輻照、保鮮劑等技術對果蔬進行保鮮[8]，但一些化學保鮮劑具有環境污染和毒副性[9]；輻照雖能殺滅病原微生物，抑制果蔬的某些代謝活動，保留原有營養和風味物質，但存在效果不顯著甚至加快果實衰老以及使用劑量的安全性問題[10-12]。

主動自發氣調(AMAP)是指通過控制密閉環境中的氣體成分，利用果蔬自身呼吸從而達到有利于保鮮目的的氣體環境的方法[13]。王亮等[14]發現50% O2+50% CO2AMAP可有效調節西蘭花體內pH值和呼吸關鍵酶活性，形成穩定的能量代謝，從而維持西蘭花貯藏品質。黃雪等[15]采用O2/CO2AMAP處理羊肚菌，貯藏第8天，100% O2處理易造成內部白斑，而過高的CO2處理則易出現白化和異味現象。Liu等[16]研究表明80% O2能防止香菇褐變，延緩膜透性和脂質過氧化的增加，并能增強抗氧化和氧自由基清除酶的活性。Fagundes等[17]表明櫻桃番茄在AMAP協同5 ℃條件貯藏，由于CO2和O2的作用，降低了呼吸速率和乙烯的產生，維持組織硬度，并抑制了如糖類、有機酸、番茄紅素等物質的化學反應，使櫻桃番茄的衰老得到了有效控制。目前，有關松露在O2/CO2AMAP中保鮮性能的研究還未見報道。試驗擬探究松露在不同初始比例的O2/CO2氣體密閉環境中的貯藏品質和微觀結構，以期得到一種新型而有效的松露鮮貯方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

松露子實體：采摘于攀枝花市，采后立即置于冰袋低溫盒中運回成都大學實驗室，短時內用濕潤軟毛刷去污、清水沖洗后摘除成熟度低、質地軟化、寄生或者損傷嚴重的個體，于層流空氣中干燥，4 ℃預冷12 h后選擇質量與成熟度相近的松露進行試驗，四川品高農產有限公司；

三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)、2,6-二氯靛酚、福林酚、戊二醛、醋酸異戊酯、鄰苯二酚：分析純，成都科隆化學品有限公司；

食品級PP保鮮盒：220 mm×130 mm×40 mm，重20 g，諸城市萬瑞塑膠有限公司；

密閉不透氣雙層PE薄膜：單層厚0.02 mm，深圳市匯豐包裝科技有限公司；

吸潮紙：昆明大道生包裝材料有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

紫外分光光度計：UV-8000型，上海精密儀器儀表有限公司；

臺式高速冷凍離心機：BY-R20型，北京白洋醫療器械有限公司；

氣調包裝機：MAP-JY260型，上海積億機械有限公司；

電導率儀：DDS-307A型，上海儀電科學儀器股份有限公司；

掃描電子顯微鏡：Phenom XL G2型，復納科學儀器(上海)有限公司；

硬度計：GY-3型，上海玖榮實業有限公司；

手持糖度計：WYT-32型，上海易測儀器設備有限公司。

1.2 試驗設計

將預冷完成的松露隨機分為4個氣調組和1個自然空氣(CK)組，每組5個氣調保鮮盒，各放入(300±5.00) g樣品，裝載量為1/4，保鮮盒底部墊一層吸潮紙，利用氣調包裝機按表1將氣體分別充入各保鮮盒，用雙層PE薄膜封口，CK陳放于空氣中，不封口。抽氣時間4.00 s；充氣時間4.00 s；熱封時間2.00 s；熱封溫度152 ℃。于4 ℃、相對濕度為90%～95%冷庫中貯藏，每7 d取樣1次，各相關指標重復測定3次取平均值。

表1 氣體組分比例Table 1 Radio of gas content %

1.3 相關指標測定

1.3.1 失重率 按式(1)計算松露的失重率[18]。

(1)

式中：

W——失重率，%；

M1——松露貯藏前質量，g；

M2——松露貯藏后質量，g。

1.3.2 可溶性固形物含量 取10 g松露于研缽，待充分研磨后用4層紗布過濾，使用手持糖度計測定可溶性固形物的百分比含量。

1.3.3 腐爛率 將軟化、霉變、發黏及異味等現象作為松露腐爛的指示標準，按式(2)計算腐爛率。

(2)

式中：

D——腐爛率，%；

X1——腐爛個數；

X2——處理總數。

1.3.4 維生素C含量 按GB 5009.86—2016執行。

1.3.5 呼吸速率 參照Ye等[19]的方法。

1.3.6 丙二醛(MDA)含量 參照Yang等[20]的方法。

1.3.7 纖維素(Cx)酶活性

(1) 酶液制取：精確稱取5.000 g松露，剪碎后置于預冷的研缽中，加入適量磷酸緩沖液研磨均勻后定容，4 000 r/min 離心20 min，上清液于4 ℃保存備用。

(2) Cx酶活性：參照劉德海等[21]的方法并稍改動，將酶液稀釋10倍待用，取6只10 mL帶塞試管，5只樣品管中加入2 mL CMC溶液，50 ℃預熱3 min，加入0.5 mL稀釋酶液，50 ℃保溫30 min。待保溫快結束時取空白管先后加入2 mL CMC溶液和2.5 mL DNS溶液。保溫結束后向各樣品管中加入2.5 mL DNS溶液并向空白管中加入0.5 mL酶液，沸水浴8 min，冷卻后空白調零測OD530 nm值。

1.3.8 多酚氧化酶(PPO)活性 參照張菊華等[22]的方法。

1.3.9 掃描電鏡 松露去皮后切成4 mm×4 mm×3 mm 小片，4 ℃下、5%戊二醛固定2 h，用0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗浸泡10 min，重復操作3次，分別用30%，50%，70%乙醇脫水20 min，用80%，90%，100%乙醇脫水10 min。醋酸異戊酯代替100%乙醇溶液脫水10 min，將試樣取出進行CO2臨界點干燥以及離子濺射噴金處理，于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.3.10 數據處理 所有試驗數據經SPSS軟件進行顯著性差異分析(P<0.05為差異顯著)，采用Excel 2016軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 對失重率及可溶性固形物含量的影響

由圖1(a)可知，貯藏期間，各處理組的失重率均呈上升趨勢，但AMAP4處理的失重最為嚴重，貯藏7 d后失重率高于CK處理，可能是隨著呼吸作用的進行，蒸騰失水的同時，氣調包裝中氧氣被快速利用，CO2含量過高致使產生無氧呼吸而造成有機物被過多消耗而導致失重率急劇上升。而其他處理的失重率在整個貯藏期間明顯(P<0.05)低于CK和AMAP4處理，且AMAP1與AMAP2處理相差不明顯，而AMAP3處理在貯藏后期才顯示出一定優勢，更適合長期保鮮。

圖1 O2/CO2 AMAP對松露失重率及可溶性固形物含量的影響Figure 1 Effect of O2/CO2 AMAP on weight loss rate and soluble solid content of truffles

由圖1(b)可知，各處理組的可溶性固形物含量均呈先增后減的趨勢，其上升可能是貯藏期間松露的失水和子實體內蛋白質等大分子向可溶性小分子的轉化而導致的，而下降是因為呼吸作用[23]。貯藏期間，4個氣調組的可溶性固形物含量均顯著高于CK處理(P<0.05)，CK與AMAP4處理的在第7天達到峰值，后又呈快速下降的趨勢。其余3個處理在第14天達到峰值，可能與不同氣調處理影響各種物質的活化速度有關，可以延長松露后熟時間，與員麗蘋等[24]的結果類似。AMAP3處理的可溶性固形物含量下降平緩且在第28天回落到初始水平，均高于其他4個處理組，說明AMAP3處理有助于降低松露對呼吸底物的消耗速率，從而減緩松露的衰老，保證其食用品質。

2.2 對腐爛率的影響

由圖2可知，隨著貯藏時間的增加，各處理組的腐爛率均呈上升趨勢，松露從土壤中挖掘出后就一直暴露在空氣中，失水和病原菌使其變得高度易腐[7]。CK處理在貯藏7 d內逐漸出現腐敗，而其他處理組在貯藏7 d后才發生腐爛且程度明顯低于CK處理，表明O2/CO2主動自發氣調在降低腐爛率上具有良好的效果。AMAP3處理的腐爛率最低，保鮮效果最好，表明一些病原微生物可能對AMAP3處理的氣體成分敏感。Hoogerwerf等[25]證實80% O2+20% CO2氣調處理可明顯抑制灰葡萄孢菌的生長。張玉笑等[26]研究表明O2/CO2主動自發氣調可更好地控制果蔬貯藏過程中枝孢菌的危害。

圖2 O2/CO2 AMAP對松露腐爛率的影響Figure 2 Effect of O2/CO2 AMAP on decayrate of truffles

2.3 對松露維生素C含量的影響

由圖3可知，貯藏期間，各處理組維生素C含量均呈下降趨勢，貯藏第7天，AMAP4處理的維生素C含量低于CK處理，且28 d內的含量均顯著低于其他3個氣調組，說明高含量的O2有利于減緩松露維生素C的下降速度且效果明顯，對維持松露的營養價值具有重要作用，而10% O2氣調處理不僅難以保留松露維生素C含量甚至會加劇其損失，與車東等[27]、楊震峰等[28]的結論類似。

圖3 O2/CO2 AMAP對松露維生素C含量的影響Figure 3 Effect of O2/CO2 AMAP on VC contentof truffles

2.4 對松露呼吸速率的影響

由圖4可知，松露是一種呼吸躍變型果實，貯藏期間，除CK和AMAP3處理外，其余氣調組的呼吸速率大體呈“M”型波動。CK處理的呼吸高峰出現在貯藏第7天，而貯藏中、后期急劇下降，可能是因為腐爛程度過高使松露的呼吸系統受到嚴重破壞。AMAP1、AMAP2和AMAP4處理具有雙呼吸高峰，分別出現在貯藏第7，21天，而AMAP3處理的呼吸高峰只在貯藏第21天出現，且呼吸速率最低。CK處理的平均呼吸速率為205.60 mg/(kg·h)，其他處理的分別為223.58，250.73，187.81，196.69 mg/(kg·h)，AMAP3和AMAP4處理的呼吸作用受到明顯抑制，而AMAP3呼吸波動最弱，表現最好，說明合適的初始氣體比例形成適宜松露貯藏的微環境，推遲了呼吸高峰并降低了呼吸速率，維持了營養品質。

圖4 O2/CO2 AMAP對松露呼吸速率的影響Figure 4 Effect of O2/CO2 AMAP on respiratoryrate of truffles

2.5 對松露MDA含量的影響

由圖5可知，除CK處理的MDA含量增加外，其余組均呈先增后降再增的趨勢，貯藏前期，MDA含量的升高可能是氣體脅迫導致松露組織產生大量的自由基，積累到一定程度后引起細胞膜脂過氧化，使膜的結構和功能受到嚴重損害，同時生成MDA加重對蛋白質、核酸及膜等大分子生物成分的攻擊，進一步損傷細胞膜，增加其透過性[29]。隨后，松露的防御機制啟動，MDA被分解致使含量下降，但隨著自我修復功能的削弱，MDA又開始合成，含量逐步上升。貯藏第28天，AMAP2和AMAP3處理的MDA含量接近但與AMAP1、AMAP4處理的差異顯著。AMAP4處理的MDA含量最高為11.68 nmol/g，而AMAP3處理的最低為5.26 nmol/g，同時在整個貯藏期間都維持在較低水平，說明其氣體比例有效地降低了MDA的積累，與黃雪等[15]的結論一致。

圖5 O2/CO2 AMAP對松露MDA含量的影響Figure 5 Effect of O2/CO2 AMAP on MDAcontent of truffles

2.6 對松露Cx酶活性的影響

由圖6可知，貯藏期間，各處理組的Cx酶活性均不斷上升，4個氣調組的Cx酶活性顯著低于CK組(P<0.05)，且初始氧氣含量在40%及以上氣調處理的Cx酶活性整體上低于10% O2的，說明較高含量的O2可以更好地抑制松露的軟化。貯藏第28天，AMAP3處理的Cx酶活性最低，分別比AMAP1、AMAP2、AMAP4處理低11.39，15.15，19.50 U/g。因此，AMAP3處理相比較于CK和其他處理，更有效地降低了Cx酶活性，從而維持了松露的硬度。有研究[30]表明，雙孢蘑菇在貯藏后期由于纖維素酶活性升高加快纖維素分解，可能出現菌體自溶現象，而維持較低的纖維素酶活力可以保持良好的質地。

圖6 O2/CO2 AMAP對松露Cx酶活性的影響Figure 6 Effect of O2/CO2 AMAP on Cxenzymeactivity of truffles

2.7 對松露PPO活性的影響

由圖7可知，貯藏第7天，4個氣調組氣體控制條件下松露的PPO活性均顯著高于CK處理的。當松露所處的環境發生改變后，PPO作為松露體內一種應激性酶對其作出響應，使得PPO活性被激活并在短時間內提高從而開啟松露抵御外界傷害的自我保護機制。一旦松露適應了這種脅迫，PPO活性將回到原狀態，故貯藏第14天的PPO活性出現了回降現象，之后，各處理組PPO活性又不斷上升，AMAP1、AMAP2及CK 3組上升迅速，其余2組上升緩慢，且AMAP3處理表現最佳，說明AMAP3處理在貯藏中、后期有效抑制了PPO活性，防止果實發生褐變。這可能是因為貯藏后期，呼吸產生的高濃度CO2形成了高壓CO2環境，而高壓CO2可能以改變PPO的三級結構或干擾PPO的疏水活性位點的方式使其失活，從而減弱了PPO活性上升的趨勢[31]。

2.8 對松露微觀結構的影響

由圖8可知，新鮮松露子囊果的子囊孢子壁外表光滑飽滿，相互之間呈致密分布，無凹陷和空洞。貯藏第14天，只有AMAP3處理的子囊孢子壁仍能保持完整飽滿且致密的結構，分布也較為均勻，子囊之間空隙小，說明其有效保留了水分，細胞壁受損程度低，有利于維持松露正常的生理活動；CK和AMAP4處理因失水過度導致子囊嚴重干癟，而AMAP1和AMAP2處理的子囊之間黏連在一塊，各子囊的形狀無法清晰分辨出。貯藏第28天，各處理組的子囊均出現一定程度的剝離和皺縮，形成空洞，但CK處理的剝離最為嚴重，子囊相互之間間隙最大，而AMAP3處理也有空洞和皺縮出現，但程度相對最淺，說明適宜氣調處理的松露可有效減少質量損失，通過維持細胞的正常形態進而減弱MDA、PPO以及Cx酶等對組織的損傷，與朱繼英等[32]、Wu等[33]的結論類似。

圖8 O2/CO2 AMAP對松露微觀結構的影響Figure 8 Effect of O2/CO2 AMAP on microstructureof truffles

3 結論

試驗表明，松露具有呼吸躍變特性，40% O2+60% CO2處理可將呼吸高峰推遲至第21天，有效減緩營養物質的損失，并將松露貨架期延長至4周。40% O2+60% CO2處理能夠保持松露子囊較為飽滿的狀態，降低纖維素酶和丙二醛對細胞壁膜的破壞，維持正常的生理活動，有利于松露保鮮。這是由于40% O2+60% CO2處理的氣體比例結合低溫形成的微環境可使松露的新陳代謝快速到達平衡，保持低能耗狀態，高含量的O2可直接抑制厭氧菌的生長繁殖并且緩解CO2的侵害，減少腐爛。后續可進一步優化不同初始氣體比例的保鮮性能，并深入研究O2/CO2主動自發氣調保鮮松露的具體機制。