化學合成類抗球蟲藥殘留檢測方法研究進展

龐杏豪

胡驍飛2

邢云瑞2

孫亞寧2

王 耀1

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003；2. 河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002)

球蟲病是由艾美球蟲屬的傳染性寄生蟲引起的疾病，其卵囊寄生于畜禽的腸道上皮細胞組織，破壞細胞的正常生理結構，導致炎癥和出血[1]，使畜禽體重減輕、產蛋率下降[2]，料肉比增加[3]。當前，臨床對球蟲的防控方式分為球蟲疫苗和抗球蟲藥，前者含有小劑量的球蟲卵囊，可在腸道定殖，通過卵囊循環使動物機體獲得免疫，起到預防效果而無治療作用[4]；后者主要用于治療也可用于預防，且選擇范圍廣，在實際養殖過程中大規模應用。近年來，獸藥殘留超標已成為食品安全監督抽檢中發現的主要不合格問題之一[5]。長期不規范使用抗球蟲藥不僅會對畜禽產生毒性作用，使其耐藥性增強，增加養殖成本，對養殖業健康發展和畜禽貿易產生不良影響；還會造成動物源性食品中殘留超標，將嚴重影響胃腸道菌群平衡，對人體健康造成潛在的慢性毒性危害[6-7]。為嚴格監控動物源食品中的獸藥殘留情況，中國制訂了食品安全國家標準[8]，規范了食品中化學合成類抗球蟲藥的最高殘留限量(見表1)。當前有關抗球蟲藥殘留檢測方法僅側重于一類檢測方法[9-10]，針對性強但全面性不夠。文章擬綜述近年來化學合成類抗球蟲藥的多種殘留檢測方法，如超高效液相色譜串聯質譜法、酶聯免疫吸附測定法、免疫層析試紙法等，以期為抗球蟲藥檢測方法的深入研究提供參考。

表1 化學合成類抗球蟲藥殘留限量標準[8]Table 1 Standard for residue limits of chemically synthesized coccidiostats

1 抗球蟲藥概述

當前，用于畜禽球蟲病防治的抗球蟲藥主要分為聚醚離子載體類、化學合成類和中草藥制劑類3類，其中化學合成類由于價格低廉、防治效果好而被廣泛使用。化學合成類抗球蟲藥包含磺胺類、吡啶類、三嗪類、二硝基類等多個種類，其作用機理各不相同[11]。磺胺類藥物與對氨苯甲酸爭奪二氫葉酸合成酶，影響葉酸形成，阻礙核蛋白合成，抑制球蟲的生長繁殖；吡啶類藥物可通過抑制蟲體的呼吸作用來影響正常的新陳代謝[12]；三嗪類抗球蟲藥通過抑制呼吸鏈酶的活性影響蟲體新陳代謝[13]；二硝基類抗球蟲藥具有廣譜活性，尼卡巴嗪可抑制琥珀酸連接的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸還原[14]；胍類抗球蟲藥阻止球蟲成熟裂殖體的形成[15]；喹啉類中癸氧喹酯抗球蟲藥可降低球蟲卵囊孢子形成率[16]；抗硫胺素類抗球蟲藥可抑制艾美球蟲對硫胺素的吸收，使硫胺素輔酶形成受阻；常山酮可抑殺球蟲早期生殖性芽孢以及第一、第二代裂殖體[17]。過量的抗球蟲藥在發揮藥效的同時，會對動物產生一定的毒副作用。高劑量的磺胺喹惡啉對幼雞的肝索細胞、肝臟淋巴區域、膽管、腎臟、骨髓和甲狀腺造成損傷[18]；氯羥吡啶對小鼠有致畸和致突變作用[19-20]；地克珠利可引起小鼠肝細胞和肝竇細胞腫脹、腸系膜組織細胞增生癥等不良反應；尼卡巴嗪在飼喂孕鼠時出現母體死亡率增加、幼鼠延遲骨化及胎兒體重降低等現象；常山酮可使牛腹瀉、胃腸道充血發炎，伴隨出現低蛋白血癥、高尿毒癥等現象[21]。

2 化學合成類抗球蟲藥殘留檢測方法

2.1 超高效液相色譜串聯質譜法

超高效液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS/MS)是一種集高效分離和多組分定性、定量于一體的方法，具有分離效率高、特異性強、靈敏度高等優點。梁飛燕等[22-23]建立了UPLC-MS/MS法用于氯羥吡啶的殘留檢測，前者選用PRIME HLB固相萃取柱作為純化柱，降低了樣品雜質的影響，提高了檢測靈敏度，定量限和檢出限遠低于后者。Zhao等[24]建立了HPLC-MS/MS和UPLC-MS/MS兩種方法檢測牛肉中8種抗球蟲藥殘留，結果表明兩種方法均具有高靈敏度和良好的準確性，可滿足不同機構所用設備的檢測需求，且UPLC-MS/MS的準確性更好。Broekaert等[25]建立了UPLC-MS/MS法用于蔬菜中地克珠利、尼卡巴嗪等6種抗球蟲藥的殘留檢測，定量限為0.30～2.98 μg/kg。在使用超高效液相色譜串聯質譜法檢測藥物殘留時，樣品的基質效應對檢測方法的定量限、檢出限、準確度和精密度均會產生不良影響。此外，該法所用儀器不僅價格昂貴，還對研究人員的檢測技術有較高要求，限制了其大規模應用。

2.2 酶聯免疫吸附測定法

酶聯免疫吸附測定法(ELISA)將酶催化反應的放大作用和抗原抗體親和反應的專一性相結合[26]，大大提高了檢測靈敏度，常被用于樣品的快速篩查。在檢測抗球蟲藥等小分子物質時，該方法多基于競爭ELISA原理建立，即通過待檢抗原與包被在固相載體上的抗原競爭性結合單克隆抗體來達到檢測目的。張夢等[27]用重氮化方法合成磺胺氯吡嗪鈉抗原，制備單克隆抗體，建立間接競爭ELISA方法檢測動物組織中磺胺氯吡嗪殘留檢測，線性檢測范圍為20～400 ng/mL。龔云飛等[28]建立了間接競爭ELISA方法檢測雞蛋和雞肉樣品中磺胺二甲嘧啶殘留，雞蛋和雞肉樣品實際檢出限分別為2，5 ng/g。Li等[29]建立了間接競爭ELISA方法檢測牛奶樣品，其中磺胺甲噁唑、磺胺喹喔啉、磺胺間二甲氧嘧啶和磺胺二甲嘧啶的檢出限分別為1.25，2.95，3.35，6.10 μg/L，為抗球蟲藥殘留檢測提供了一種簡單、靈敏、高通量的篩選工具。Zhang等[30]建立了一步間接競爭ELISA方法，用于動物源性食品中地克珠利的殘留檢測，IC50為0.952 μg/kg，相較于傳統間接競爭ELISA方法至少節省30 min。Bai等[31]同時建立了直接競爭ELISA方法和非競爭性ELISA方法用于雞肉中常山酮殘留檢測，與使用相同抗體的競爭法相比，非競爭性ELISA方法在靈敏度和檢測范圍方面顯示出明顯優勢，檢出限為0.13 ng/mL，線性檢測范圍為1.3～53.4 ng/mL。ELISA方法中常用的辣根過氧化物酶等天然酶的催化活性有限，穩定性受環境、溫度等因素的影響較大。在檢測過程中，抗體和包被原濃度、各操作過程的反應時間都會影響ELISA結果，大量的手動加樣步驟易導致人為誤差。

2.3 免疫層析試紙法

免疫層析試紙法是在單克隆技術、免疫層析技術及標記技術基礎上發展起來的一種快速檢測方法，具有靈敏度高、特異性強、攜帶方便等優點，在獸藥殘留的快速檢測方面發展迅速。免疫層析試紙條主要由帶壓敏膠的支撐底板、NC膜、吸水紙、膠金墊、樣品墊按序組裝而成[如圖1(a)]，根據檢測所需在NC膜上噴涂C線和T線，其中C線作為質控線始終顯色，若不顯色即為試紙失效。在檢測抗球蟲藥這類小分子物質時，多以膠體金為顯色媒介構建膠體金免疫層析試紙[32-35]。反應原理如圖1(b) 所示，當樣品中不含待測物時，金標抗體先后與T線上的包被抗原以及C線上的羊抗鼠二抗反應，T、C線均顯色，呈陰性；當樣品中含有待測物時，待測物與包被原競爭有限的金標抗體，且待測物含量越高，T線顯色越淺，呈陽性。Wang等[36]建立了膠體金免疫層析試紙法用于檢測雞肉樣品中的地克珠利，15 min即可完成檢測過程，定性及半定量臨界值為20 μg/kg，機讀檢出限為1.08 μg/kg。Chao等[37]用高靈敏度單克隆抗體創建膠體金免疫層析試紙法，用于快速篩查生雞肉樣品中氯羥吡啶殘留，定性及半定量臨界值為5 μg/kg，機讀檢出限為0.14 μg/kg。盡管基于膠體金免疫層析試紙法的建立已經成熟化，但針對抗球蟲藥的檢測靶標相對單一，無法滿足多種藥物同時檢測的需求，而且其靈敏度依賴于抗體的特性和標記物的穩定性，靈敏度與假陰性問題始終是困擾該方法的關鍵問題。

圖1 免疫層析試紙的組成及原理示意圖[32]

2.4 表面增強拉曼光譜法

表面增強拉曼光譜(SERS)法是一種靈敏度更高、信號更強的拉曼技術[38]，已被應用于動物性食品中抗球蟲藥殘留檢測。金納米粒子(AuNPs)是SERS法常用的活性基底，可顯著增強SERS信號強度[39]，提供好的化學穩定性和生物相容性。Li等[40]以微波法合成磁性離子液體/金納米粒子(MIL-AuNPs)作為SERS底物，用于測定雞蛋樣品中的氯羥吡啶殘留，MIL-AuNPs粒徑均一分散，SERS信號明顯高于普通AuNPs(見圖2)，該方法檢出限低至0.5 μg/kg。銀納米粒子(AgNPs)表面增強活性高于AuNPs[41]，在實際應用中效果更佳。Shao等[42]將AgNPs應用于SERS法檢測鴨肉和雞肉樣品中二硝托胺和托曲珠利殘留，線性濃度范圍分別為0.30～33.30，0.30～66.70 nmol/L，檢出限分別為0.915，1.03 nmol/L。雙金屬納米結構相比于單一金屬基底具有更好的SERE活性，Bi等[43]基于AuNPs和AgNPs制備出核殼結構作為SERS底物，檢測雞、鴨樣品中鹽酸氨丙啉殘留。在檢測過程中藥物分子固定于金核和銀殼之間，顯著增強了藥物的拉曼信號，且Au@Ag納米粒子的負電性使其通過靜電作用均勻地分散在水中，形成穩定的膠體。隨著檢測靈敏度的提高，對SERS基底性能的要求越來越高，合成優良性能的基底成為新的研究方向。

圖2 微波法合成磁性離子液體/金納米粒子作為超靈敏SERS基底用于痕量氯羥吡啶檢測[40]Figure 2 Microwave method synthesis of magnetic ionic liquid/gold nanoparticles as ultrasensitive SERS substratesfor trace clopidol detection

2.5 毛細管電泳法

毛細管電泳法是一種依據帶電化合物在高壓電場中分配系數和淌度差異達到鑒定和分離目的的強大工具[44]，因其快速、高效率、樣品消耗量少的顯著優勢而被廣泛應用[45]。樣品前處理是毛細管電泳法開發的關鍵，在線固相萃取技術的應用是樣品凈化的重要手段，同時也是提高實驗室通量的最佳策略之一。Ma等[46]在毛細管電泳法中應用了離線分散液—液微萃取與在線場放大樣品進樣相結合的雙富集方法，用于同時測定包括磺胺二甲嘧啶在內的4種磺胺類藥物，為復雜水基質中磺胺類藥物測定提供了廣闊前景。張建等[47]使用膠束溶劑堆積法在線富集模式并進行條件優化，建立了高效毛細管電泳法檢測雞蛋中3種磺胺類藥物殘留，檢出限約1.0 ng/mL。實際檢測過程中，現有技術與毛細管電泳法結合使用，有利于提高檢測靈敏度。

2.6 電化學傳感器

電化學傳感器可在復雜基質中實現抗球蟲藥殘留的快速檢測，其靈敏度與電極的性能息息相關。而在電極表面修飾碳納米管、石墨烯、石墨碳氮化物等不同的材料，可提高電極靈敏度、選擇性和穩定性[48]。Huang等[49]將合成分子印跡聚合物固定在氧化石墨烯和二氧化鈦修飾的鉑電極表面，制備了分子印跡電化學傳感器(圖3)，用于雞肌肉和雞蛋樣品中托曲珠利檢測。氧化石墨烯和二氧化鈦具有較大的活性表面積和較高的催化活性，可放大電化學信號，提高傳感器的靈敏度。改性碳糊電極可同時修飾多種生物傳感器材料，具有較寬的工作電位范圍，且易制備、成本低、表面構建過程方便快捷，近年來被廣泛應用[50]。Soleymanpour等[51]用磺胺喹喔啉鈉與2,3,5-三苯基四唑氯化物制備離子絡合物應用于碳糊電極，制備了電化學傳感器傳感器，并用于測定生物樣品和牛奶中磺胺喹喔啉，檢出限低至3.0×10-6mol/L。Abdel-Raoof等[52]制備了氧化鎳納米粒子修飾多壁碳納米管作為傳感材料，用于雞肉中鹽酸氨丙啉的殘留檢測。與裸碳糊電極相比，該電極響應時間短、重現性良好，方法檢出限低至6.3×10-7mol/L，線性范圍為10-6～10-2mol/L。目前大多數電化學傳感器的構建都處于實驗室階段，實現批量化生產需要考慮不同修飾材料的穩定性、生產成本以及攜帶便捷性等問題。

圖3 分子印跡電化學傳感器示意圖[49]Figure 3 The schematic illustration of the molecularly imprinted electrochemical sensor

3 總結與展望

化學合成類抗球蟲藥常在家禽的生產養殖過程中使用，出于對消費者健康考慮，近年來中國已經為動物源性食品中的抗球蟲藥殘留設定了相關限量標準，促使抗球蟲藥殘留檢測方法朝著靈敏度更高、特異性更好的方向發展。色譜法檢測極性抗球蟲藥殘留物時，常規的反相色譜吸附劑不能達到理想的分析效果，需要開發更有效的樣品制備程序，以減少由樣品基質引起的離子抑制或增強作用。目前已有的免疫學檢測方法中，天然酶的活性限制了研究的發展，而納米材料的酶模擬物(納米酶)作為一種新型的人工酶，具有合成容易、穩定性好、成本低、設計靈活等顯著特性，不僅有望替代天然酶在ELISA中廣泛應用，還可作為標記物用于免疫層析試紙法。同時，開發新型高效基底是SERS法發展的關鍵，新型稀土摻雜半導體基底[53]、MOF基底[54]以及仿生結構的SERS基底[55]已分別應用至醫學、藥殘檢測領域，未來會有更多的新型材料用于基底研發，實現食品中抗蟲球藥殘留的快速靈敏檢測。毛細管電泳與質譜法、化學發光法等現有技術聯用是未來發展的重點，既提高了檢測效率和精確度，也為藥殘檢測提供了新的方向。對于電化學傳感器來說，功能化界面的不可再生性導致電極只能滿足單個樣品的測試，難以通過批量化檢測來降低成本，因此開發靈敏度高、穩定性好、可重復使用的電極應用于電化學傳感器，將推動電化學傳感器朝著小型化、便捷化方向發展。