DES-UPLC-MS/MS法測定水產品中4種四環素藥物殘留

劉子雄

謝國丹1

譚貴良2

鄭鴻濤1

董 海1

黃景輝3

(1. 中山市食品藥品檢驗所，廣東 中山 528437；2. 電子科技大學中山學院，廣東 中山 528402；3. 廣東利誠檢測技術有限公司，廣東 中山 528436)

低共熔溶劑(DES)是由一定化學計量比的氫鍵受體(如季銨鹽)和氫鍵給體(如醇、羧酸、氨基酸和糖等)通過分子間氫鍵作用組合而成的低共熔混合物[1]。其毒性低、綠色環保、可生物降解，可以作為不同物質的萃取溶劑，且原料價格低廉、制作簡便。Zhang等[2-4]將DES應用于食品中合成著色劑及非法添加工業染料的檢測，張康迪等[5]將氯化膽堿/乙二醇組成的DES用于食用大豆油中抗氧化劑TBHQ的檢測，Zhao等[6]將脯氨酸/丙二醇組成的DES用于食品中農藥殘留的檢測，Shishov等[7]將四丁基溴化銨/丙二酸/乙酸3組分組成的DES用于雞肉中磺胺類獸藥殘留的檢測；在天然產物分析[8-13]和環境分析[14-17]方面也有相關應用報道。但有關DES在食品中四環素類抗生素檢測分析中的應用尚未見報道。

四環素類抗生素是一類由放線菌屬產生的或半合成的廣譜抑菌劑，包括四環素、土霉素、金霉素和強力霉素等，可作用于多數革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性敏感菌，臨床上用于立克次體、衣原體和支原體等所致感染。水產養殖中，因四環素類藥物對水產動物的嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌等病原菌有效，故被廣泛用于預防和治療水產動物疾病[18]。當前，食品中四環素類抗生素定量檢測的主流方法為高效液相色譜法和液相色譜—串聯質譜法，其前處理過程分為兩種：① 使用Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液或酸化乙腈提取，再經固相萃取(SPE)小柱凈化，濃縮復溶后上機檢測[19-21]；② 用酸化乙腈—水體系提取目標物，然后經QuEChERS方法凈化后上機檢測[22-23]。兩種方法均會使用較多的有毒有機試劑，對環境不友好，且用SPE小柱凈化操作繁瑣，耗時較長。試驗擬使用DES這種新型、綠色萃取技術，結合超高效液相色譜—串聯質譜(UPLC-MS/MS)法建立水產品中四環素類藥物殘留的檢測分析方法，為實現市售水產品的快速定性和定量檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蝦、草魚、白鱔、多寶魚及三文魚等13 批水產品：市售；

蝦肉中四環素定量分析質控樣品：中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心；

蝦肉中四環素測定能力驗證測試樣品：英國Fapas分析實驗室；

甲醇：色譜純，德國Merck公司；

甲酸：色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司；

氯化膽堿、乙二醇、丙三醇、丁二醇：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

標準物質鹽酸四環素(97.15%)、鹽酸土霉素(96.02%)、鹽酸金霉素(92.9%)及鹽酸強力霉素(99.3%)：德國Dr Ehrenstorfer公司。

1.1.2 主要儀器設備

超高效液相色譜—三重四級桿串聯質譜儀： 1290/6460C型，帶Jet Stream電噴霧離子源(JetESI)，美國Agilent公司；

純水系統：Milli-Q Integral 3 System型，美國Millipore公司；

冷凍離心機：3-18 K型，德國Sigma公司；

分散機：T25 easy clean digital型，德國IKA公司；

超聲波清洗儀：SCQ-7201E型，上海聲彥超聲波儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DES的制備 選用氯化膽堿作為氫鍵受體，乙二醇、丙三醇和1,4-丁二醇作為氫鍵給體，按不同化學計量比稱量至250 mL雞心瓶中，置于旋轉蒸發儀中，常壓下、70 ℃水浴攪拌，直至形成透明均一的液體，最終得到11 種不同類型的DES，詳見表1。

表1 不同類型的低共熔溶劑Table 1 Different types of DES

1.2.2 標準儲備液及工作液的配制 準確稱取按其純度折算為100%質量的四環素、土霉素、金霉素和強力霉素各10.0 mg，分別用甲醇溶解并定容至10.00 mL，得質量濃度為1 mg/mL的儲備液。再分別取適量四環素、土霉素、金霉素和強力霉素儲備液，用甲醇定容至10.00 mL，得質量濃度為1 μg/mL的混標中間工作液。繪制標準工作曲線時，根據樣品情況用陰性基質提取液稀釋中間工作液至不同濃度，現配現用。

1.2.3 儀器分析條件

(1) 色譜條件：InfinityLab Poroshell 120 EC-C18色譜柱(3.0 mm×150 mm，2.7 μm)；流速0.4 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積5 μL；流動相A為0.1%甲酸水溶液，B為甲醇，梯度洗脫程序：0.0 min，95% A；2.5 min，85% A；6.9～7.0 min，80% A；9.0～12.5 min，40% A；13.0 min，95% A。

(2) 質譜條件：帶Jet Stream電噴霧離子源(JetESI)；多反應監測(MRM)；ESI+模式掃描；鞘氣流量11 L/min；鞘氣溫度350 ℃；霧化氣壓力0.31 MPa；噴嘴電壓500 V(ESI+)/1 000 V(ESI-)；毛細管電壓4 000 V(ESI+)/3 500 V(ESI-)；駐留時間20 ms，其他條件見表 2，質譜圖見圖 1。

圖1 四環素類藥物質譜圖Figure 1 Mass spectrum of tetracyclines

表 2 四環素類藥物的質譜信息?Table 2 Mass parameters of tetracyclines

1.2.4 樣品前處理方法 稱取1.00 g樣品至15 mL帶刻度塑料離心管中，加入DES提取液3.0 mL，冰水浴10 min，均質1 min，冰水浴超聲10 min，5 ℃、10 000 r/min 離心5 min，將上清液轉移至帶刻度15 mL離心管中；殘渣中加入3.0 mL DES提取液，重復提取1次，合并上清液，用初始流動相定容至7.0 mL。過0.22 μm 聚四氟乙烯(PTFE)針式濾膜，上機檢測。

1.2.5 DES條件優化

(1) DES種類選擇：在1 g陰性蝦肉樣品中添加200 μL 的混標中間工作液(1 μg/mL)，分別用制備好的DES進行提取，按1.2.4的方法進行檢測，考察DES種類對分析藥物提取效率的影響。

(2) DES含水量：在最優DES中加入不同比例的水作為提取溶劑，按1.2.4的方法對1 g陰性加標樣品(添加量200 ng)進行檢測，考察低共熔溶劑含水量(80%，85%，90%，95%)對分析藥物提取效率的影響。

(3) DES溶劑pH：以蝦肉中四環素測定質控樣為樣品，以最優含水量下的最優DES為提取溶劑1(pH 8.56)，在溶劑1中分別添加至含0.1%，0.5%，1.0%的甲酸后作為提取溶劑2(pH 2.60)、溶劑3(pH 2.25)和溶劑4(pH 2.07)，按1.2.4的方法進行檢測；將GB/T 21317—2007 中Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液(pH 4.0)作為提取溶劑5，考察低共熔溶劑pH對分析藥物提取效率的影響。

1.2.6 線性和檢出限的測定 取四環素類藥物混合標準使用液，用陰性基質提取液稀釋配置成 5.0，10.0，20.0，100.0，200.0 ng/mL的混合標準工作液，按1.2.3的方法進樣測定，以質量濃度為橫坐標，各分析物定量離子的離子豐度為縱坐標，繪制標準工作曲線，考察標準工作曲線的線性范圍和相關系數。試驗條件下，取陰性樣品1 g，加入不同濃度的混標溶液，按1.2.4 的方法進行前處理，上機檢測，依照信噪比為3(S/N=3)計算檢出限(LOD)。

1.2.7 方法精密度和準確度的測定 方法精密度以相對標準偏差(RSD)表示，按1.2.4的方法處理檢測，計算6次平行測定結果的RSD，以驗證方法的精密度。準確度以樣品加標回收率表示，對試樣進行3個濃度水平加標，每個水平重復3 次，以驗證方法的準確度。

1.2.8 數據處理 使用安捷倫 Date Acquisition、Qualitative Analysis和 Quantitative Analysis工作軟件對研究的 4 種四環素類分析藥物的定量定性離子進行數據處理，保留時間和定性離子進行定性，峰面積外標法定量；用 Excel 軟件對DES條件優化數據、精密度、回收率及樣品含量數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理方法優化

2.1.1 DES種類的選擇 DES制備過程中發現，制備好的DES-10和DES-11冷卻至室溫(25 ℃)后會有結晶析出，是因為隨著溫度的降低，DES組分之間的氫鍵被破壞，因此其不適用于室溫以下對目標物的萃取，而另外9種 DES在室溫條件下呈液態，可用于后續研究。由圖2可知，DES-3和DES-6對4種四環素類藥物有較優的提取效率，但對于金霉素，DES-6比DES-3有更優的提取效率，所以選擇DES-6(氯化膽堿/丙三醇，摩爾比1∶4)作為試驗方法的最佳提取溶劑。

圖2 溶劑對分析藥物提取效率的影響Figure 2 Effect of solvent types on extraction efficiencyof four analytes

2.1.2 DES含水量的選擇 親水性低共熔溶劑的黏度較大，不適合直接提取，且含水量是影響目標組分提取效果的重要因素，加入適量的水可有效降低DES的黏度及調節其極性[11-12]。由圖3可知，當低共熔溶劑含水量由80%上升至95%時，四環素類藥物提取率均發生顯著變化，四環素呈增加趨勢，土霉素、金霉素和強力霉素呈先增加后降低的趨勢，當含水量為90%時達最大值，綜合考慮選擇含水量為90%的DES-6進行后續研究。

圖3 低共熔溶劑含水量對分析藥物提取效率的影響Figure 3 Extraction efficiency of analytes using DESwith different moisture content

2.1.3 DES溶劑pH的選擇 四環素類藥物在堿性條件下易生成異構體，在較強酸性環境中(pH<2)易發生消去反應生成脫水物，發生降解[20-21]。由表3可知，溶劑1處理結果遠低于質控樣的特性值，是因為溶劑1的pH處于弱堿性，四環素容易生成異構體，從而影響結果；溶劑2、溶劑3、溶劑4、溶劑5處理結果均在特性值區間范圍內，符合要求，且運用DES前處理和運用GB/T 21317—2007前處理結果無顯著差異，因此選擇溶劑2(pH 2.60)作為試驗方法的最終提取溶劑。

表3 pH對四環素提取效率的影響Table 3 Effect of pH on extraction efficiency of tetracycline μg/kg

2.2 方法的線性和檢出限

由表4可知，各分析藥物均呈良好線性關系，r≥0.999 4。分析藥物的LOD為20.0 μg/kg，而GB/T 21317—2007中四環素、土霉素、金霉素和強力霉素的LOD均為50 μg/kg。綜上，試驗方法具有較高的靈敏度。

表4 分析藥物的線性范圍和檢出限Table 4 Linear equations and limits of detection(LOD) of the analytes

2.3 方法的精密度和準確度

由表5可知，RSD(n=6)為3.4%～5.2%，<10%；4種四環素類藥物在3個加標水平下的加標回收率為82.2%～102.8%，符合日常分析檢測的要求。

表5 回收率和精密度Table 5 Recovery and precision (n=6)

2.4 樣品檢測

運用試驗方法對市售的13批水產品(蝦6批，三文魚2批，草魚3批，白鱔及多寶魚各1批)、1批質控樣及1批國際能力驗證測試樣品進行檢測分析，結果表明，市售水產品中有1批次蝦肉分別檢出土霉素(64.8 μg/kg)和強力霉素(25.4 μg/kg)，而質控樣品和國際能力驗證樣品的檢出值均在給定已知的特性區間范圍內，說明試驗建立的方法檢測結果準確。

3 結論

建立了低共熔溶劑萃取—超高效液相色譜—串聯質譜法(DES-UPLC-MS/MS)快速檢測水產品中的四環素、土霉素、金霉素和強力霉素的分析方法。結果表明，與傳統的SPE固相萃取凈化技術相比，試驗方法前處理具有有機試劑用量少、毒害小、操作步驟簡便及處理時間短等特點，且分析系統具有良好的線性關系和更低的檢出限，可用于水產品中四環素類藥物殘留的快速定性和定量檢測。在DES條件優化中，低共熔溶劑氫鍵受體和氫鍵給體選擇方面還是比較單一，后續可嘗試更多的組合來制備DES，從而尋求更優的試驗方案。