人參皂苷Re對APP/PS轉基因癡呆小鼠學習記憶力及海馬Caspase-3、P53蛋白的影響

王月靜 張萌 張海燕 郎尉雅 馮化杰 孫麗慧

(1齊齊哈爾醫學院 1組胚教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161001；2形態學實驗室)

人參皂苷是從中藥材“人參”中提取出來的活性成分，人參中可分離出40多種單體。其中人參皂苷Re是人參發揮作用的關鍵單體之一，且含量較高。它被認為有延緩衰老和促進智力的作用〔1，2〕，學者們經過長期研究發現，人參皂苷Re能夠降低阿爾茨海默病(AD)細胞內淀粉樣前體蛋白(APP)及β淀粉樣蛋白(Aβ)表達，改善AD的基本病變，結果表明該中藥對癡呆疾病可能有防治的作用〔3〕，因此我們推測人參皂苷Re對AD動物模型中也可能有保護作用。本研究旨在探討人參皂苷Re對AD小鼠學習記憶力及半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3與P53蛋白的影響。

1 材料和方法

1.1主要試劑 兔源Caspase-3、P53一抗及兔源二抗均購自北京博奧森生物技術有限公司，人參皂苷Re購自上海研生實業有限公司。

1.2實驗動物 健康12 w齡雄性APP/PS轉基因癡呆小鼠，體質量25～30 g，購自南京大學實驗動物中心〔可證號 IACUC-DB-16-0602〕。動物在適應環境1 w后開始實驗。實驗均在標準清潔級動物實驗室內完成，自由飲水。

1.3實驗動物分組 50只小鼠隨機分為對照組、AD組、低-Re組(人參皂苷Re：5 mg/kg)、中-Re組(人參皂苷Re：10 mg/kg)、高-Re組(人參皂苷Re：15 mg/kg)，每組10只，給藥組每日灌胃1次，灌胃時間3個月，正常與AD組給予灌胃蒸餾水。

1.4Morris水迷宮 實驗結束后檢測各組小鼠學習記憶的能力，每天上午9點開始訓練，連續訓練6 d為定位航行實驗，第7天為空間探索實驗。

1.4.1定位航行驗 將小鼠面朝池壁隨機從4個象限之一放入水中，記錄小鼠找到隱藏在水下平臺的時間，即逃避潛伏期，如果小鼠120 s內未找到平臺則引導其找到平臺，并讓其在平臺上停留15 s。每次訓練完成后記錄6 d內各組小鼠逃避潛伏期。

1.4.2空間探索實驗 定位航行實驗結束后把平臺撤去，記錄小鼠穿越平臺的次數、平臺所在象限的滯留時間。

1.5甲苯胺藍法檢測海馬組織 將石蠟切片放入60℃烤箱，60 min；脫蠟，水化，甲苯胺藍染色后脫水，用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察各組海馬組織CA1區海馬神經元變化。

1.6免疫組織化學法檢測海馬組織 將石蠟切片放入60℃烤箱，60 min；脫蠟，水化，抗原修復后滴加一抗，滴加二抗，繼而行二氨基聯苯胺(DAB)顯色；復染，脫水，封片：中性樹膠；采用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件對海馬組織Caspase-3、P53表達進行半定量分析。

1.7圖像分析 用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統對免疫組化及免疫印跡結果進行圖像分析。將平均光密度值計算出來。

1.8統計學分析 采用SPSS13.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1人參皂苷Re對AD模型小鼠行為學影響 將各組小鼠放入水中進行訓練3 d，第4天開始記錄數據記錄，記錄各組小鼠逃避潛伏期，共記錄3 d。與對照組相比，AD組逃避潛伏期顯著延長，與AD組比較，高、中、低-Re組潛伏期顯著縮小(P<0.05)，其中以高劑量組最好。與對照組相比，AD組目標象限停留時間明顯縮短，穿越平臺次數明顯減少，與AD組比較，低、中、高-Re組目標象限停留時間逐漸明顯增長，穿越平臺次數明顯增加(P<0.05)，其中以高劑量組最高，見表1。

表1 各組逃避潛伏期、目標象限停留時間、穿越平臺次數比較

2.2甲苯胺藍染色結果 正常組海馬區神經元整齊排列，神經元清晰可見的細胞合成圓形，著色較淺，所以可以清晰見到核仁，AD組海馬區神經元輪廓不清，整個細胞皺縮，細胞變小，胞質染色加深，與AD組相比，低-Re組、中-Re組、高-Re組細胞體積顯著變大，細胞核染色變淡，核仁可見，胞質染色變淺，見圖1。

圖1 各組海馬區神經元形態(甲苯胺藍染色，×200)

2.3免疫組織化學實驗結果 人參皂苷Re對AD小鼠海馬區神經元Caspase-3蛋白(陽性表達在胞質)與P53蛋白(陽性表達在胞核)表達的影響，對照組海馬區神經元很少著色。AD組海馬區神經元棕褐色陽性結果明顯。與對照組比較，AD組Caspase-3、p53蛋白表達明顯升高(P<0.05),與AD組比較，低、中、高-Re組Caspase-3蛋白與P53蛋白表達顯著降低，呈劑量依賴性(均P<0.05)，見圖2、3、表2。

圖2 各組海馬區神經元caspase-3蛋白免疫組織化學染色結果(×200)

圖3 各組海馬區神經元p53蛋白免疫組織化學染色結果(×200)

表2 各組caspase-3、p53蛋白表達比較

3 討 論

AD臨床表現為學習記憶障礙，一般患者僅有十年左右壽命，嚴重威脅患者的生命質量，給家人帶來極大的痛苦，因此，選擇有效的治療手段迫在眉睫〔4～6〕。

本研究結果顯示通過游泳訓練后AD模型小鼠呈現學習記憶力顯著下降，逃避潛伏期逐漸增加，最后撤掉平臺后穿越平臺次數減少，研究發現AD的臨床綜合表現與腦組織的海馬區神經元損傷有關，損傷后海馬區神經元結構排列紊亂細胞發生壞死甚至凋亡，從而引起認知功能障礙使其學習記憶能力顯著下降。因此，本研究進行甲苯胺藍染色和細胞凋亡實驗觀察海馬區神經元變化，最終結果AD在發病過程中可出現多種病理改變，其中神經元發生的凋亡是發揮生理作用的關鍵步驟之一，AD發病過程中包括多種凋亡調節因子，如Caspase、P53、Bcl-2家族、PS等。

其中Caspase-3在機體細胞凋亡過程中發揮關鍵作用，它成為凋亡過程中的關鍵執行者，發揮效應的Caspase-3蛋白會被凋亡信號誘導，誘導后該蛋白會被激活，該分子會使細胞內靶物質降解，從而讓細胞凋亡過程順利進行。有學者發現癡呆模型動物海馬組織中Caspase-3濃度升高，提示體內Caspase-3酶的活性被激活〔7，8〕；P53基因也可調控細胞凋亡，在應激狀態下時(如缺血、缺氧)，機體的腦組織神經元被損傷時P53蛋白會被激活，此時該蛋白由不穩定狀態變為穩定，它可誘導細胞凋亡的過程，最終它可使損傷神經元凋亡，前輩研究發現癡呆模型海馬組織中P53蛋白表達升高〔9，10〕，以上研究提示Caspase-3蛋白與P53蛋白參與癡呆發病過程。

本研究結果發現，人參皂苷阿Re對AD小鼠海馬區受損神經元起到保護作用，人參皂苷Re可改善癡呆小鼠學習記憶力，降低海馬神經元Caspase-3、P53蛋白的表達，這與上述文獻結果相似，我們推測人參皂苷Re對AD的影響機制可能為降低其受損海馬神經元凋亡有關，但本文只對人參皂苷Re治療AD疾病作用進行了初探，其具體作用機制需要更深入研究。