AMG9810對帕金森病大鼠學習記憶能力的影響及其機制

謝陽 劉夢蘭 羅思維 孟仁亮 李作孝 (西南醫科大學附屬第一醫院神經內科，四川 瀘州 646000)

帕金森病(PD)主要臨床表現包括有肌強直、靜止性震顫、運動性遲緩及姿態障礙〔1〕。 動物研究表明多巴胺能神經元的缺失可導致PD模型動物的認知功能受損〔2〕。目前普遍認為多巴胺神經元的死亡與環境毒素、遺傳因素、氧化應激、免疫系統異常和神經興奮毒性增強等諸多因素〔3,4〕均有關聯。其中氧化應激因素與 PD 黑質致密區多巴胺神經元病理性缺失及PD發病的關系尤為密切，其被認為與PD的諸多病理生理過程及行為學表現有關〔5〕。

辣椒素受體(TRPV)是一 種廣泛分布于包括黑質區在內的大腦各腦區的非特異性陽離子通道〔6〕。 體內外的實驗研究〔7，8〕均證明 TRPV1 受體的激活可誘導中腦多巴胺神經元的死亡。因此，阻斷 TRPV1 受體的激活可能對該腦區的神經元起到保護作用。本研究觀察TRPV1受體阻斷劑 AMG9810 處理對PD大鼠學習記憶能力的影響。

1 材料與方法

1.1動物 成年雄性Sprague-Dawley 大鼠，6～8周齡，體重200～250 g，均購于成都達碩實驗動物有限公司，編號：SPFC5717-199，飼養條件如下：分為4只一籠，在室溫為22℃，濕度為50%～60%的安靜環境下飼養，12 h人工晝夜(8∶00～20∶00光照)，通風均良好，大鼠可自由地攝水攝食，實驗的動物使用程序均按照西南醫科大學實驗動物管委員會的相關操作條例。

1.2主要試劑 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氮吡啶(MPTP，武漢阿斯本生物技術有限公司，貨號AS1075)，AMG9810(ASPEN，貨號AS1004)，活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase3)一抗(ASPEN，貨號AS1086)，超氧化物歧化酶(SOD)和脂質過氧化物丙二醛(MDA)試劑盒(國藥集團化學試劑有限公司，貨號10023418)。

1.3MPTP 誘導PD大鼠模型的建立 腹腔注射 4%水合氯醛將大鼠麻醉后，將其固定于腦立體定位儀上，頭部去毛并用碘伏消毒手術周圍區域。查閱大鼠解剖圖譜和參考前期文獻，模型組大鼠按照立體坐標前鹵前后(AP):-5.0 mm;中縫左右(ML):±2.0 mm;顱骨硬腦膜平面向下(DV):-7.7 mm〕往大腦雙側進行 MPTP(1 μmol 溶于 2 μl生理鹽水) 注射，對照組大鼠則在相同位置注入等量的生理鹽水，手術14 d后進行水迷宮行為學測試。為了觀察 TRPV1 受體阻滯劑對大鼠學習記憶能力的影響，另將 30 只大鼠隨機分為對照組、模型組和給藥組， 并按照上述立體坐標分別往大鼠顱內注入生理鹽水或者MPTP，其中給藥組在在手術后第一天開始通過立體注射的方式連續給予 AMG9810(10 nmol/0.5 μl)顱內離體定位注射14 d，然后將各組大鼠行水迷宮實驗觀察學習記憶能力的變化。

1.4Morris 水迷宮實驗 各組大鼠連續訓練4 d，在訓練期間分別從4個不同的起始部位放入迷宮中，將登陸平臺作為最終的目標，第4天采用水迷宮數據采集和分析軟件記錄相關數據及圖像結果：有效區停留的時間、穿越平臺的次數、到達平臺的潛伏期。

1.5SOD和MDA的檢測 大鼠處死后分別取腦組織，并按照檢測說明書測定SOD活力及MDA含量。

1.6活化 Caspase3 蛋白表達水平的檢測 水迷宮測試完畢之后立即將大鼠處死，根據大鼠圖譜在大鼠的黑質區取材。將組織研碎并重懸于配好的細胞裂解緩沖液中，經12 000 r/min 離心后，將蛋白質提取出來，采用二喹啉甲酸(BCA)法進行蛋白定量以后將其煮沸而變性，取出等量樣品以12%的十二烷基鈉鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行電泳。在進行電泳后在聚偏氟乙烯(PVDF)膜上印上蛋白，然后把 PVDF 膜在5% 脫脂牛奶之中浸泡，在室溫中封閉 2 h，接著將活化的 Caspase3 抗體(1∶5 000)在4℃的溫度中孵育過夜，再使用辣根過氧化物酶標記的特異性二抗(1∶5 000)在室溫當中進行搖床孵育 2 h， TBST 液漂洗3遍(以8 min/遍的速度)后，加入化學發光的底物，并將其顯影在凝膠成像系統中，最后使用美國國立衛生研究院開發的 Image J 軟件對條帶灰度加以分析。通過去計算各組目的蛋白條帶的灰度值與內參蛋白 β-actin 灰度值之間的比值，對目的蛋白進行半定量，同時去比較各組間目的蛋白的表達水平的差異。

1.7統計學處理 采用GraphPad Prism軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1各組學習記憶能力比較 模型組經MPTP損傷后，其到達平臺的潛伏期較對照組顯著延長(P<0.05)；在有效區停留的時間和穿越平臺的次數與對照組相比顯著下降(P<0.01)。見表1。給藥組經TRPV1受體阻斷劑AMG9810處理后，其到達平臺的潛伏期較模型組顯著降低(P<0.05)； 而與模型組相比，給藥組有效區停留的時間和穿越平臺的次數則顯著升高。見表2。

2.2AMG9810 處理對SOD活性和MDA含量的影響 與對照組相比，模型組SOD活性顯著降低，而MDA含量則顯著升高(均P<0.01)。給藥組SOD活性較模型組顯著升高，MDA含量則較模型組明顯降低(均P<0.01)。見表3。

表1 MPTP損傷對大鼠學習記憶能力的影響

表2 AMG9810處理對大鼠學習記憶能力的影響

表3 各組處理組大鼠SOD活性和MDA水平

2.3AMG9810 處理對 Caspase-3蛋白表達水平的影響 模型組活化 Caspase3蛋白表達水平(3.07±0.25)較對照組(1.12±0.12)顯著上升，給藥組活化Caspase3蛋白表達水平(1.78±0.34)較模型組顯著降低(均P<0.01)。見圖1。

圖1 各組Caspase-3 蛋白表達水平

3 討 論

PD同樣有非常特征性的病理改變，即中腦黑質中的多巴胺能神經元出現變性及死亡，從而導致紋狀體多巴胺的含量顯著性減少而引起該病的發生。除了在SN多巴胺神經元的損失,PD中另一個病理變化是突觸核蛋白及TRPV1過度表達激活后而誘發氧化應激反應、細胞凋亡及線粒體損傷，尤其是主要病理形式，α-突觸核蛋白的磷酸化和不可溶〔9～11〕，PD動物模型中MPTP應用顯著增加TRPV1的氧化應激和線粒體結構異常〔12,13〕。

重要的是,慢性使用AMG9810處理顯著地抑制MPTP導致的TRPV1過表達激活,可能會減少氧化應激和線粒體功能障礙,從而造成運動功能的改善。MPTP處理小鼠中AMG9810成功地扭轉了MDA和抗氧化酶SOD的下降，而TRPV1 是一種同源四聚體的、非選擇性陽離子通道,研究表明該受體的激活能夠起到降血壓和降膽固醇及促進肌肉增長、抑制肌肉萎縮等功效。研究〔14～16〕證實TRPV1的激活可誘導中腦多巴胺神經元的死亡，而相反，阻斷該受體的激活可以對多巴胺神經元起到保護作用。本實驗結果發現 TRPV1 受體阻滯劑 AMG9810 的連續處理可顯著改善 MPTP 對大鼠學習記憶能力的損傷。與此同時，AMG9810 還能通過增強 SOD 活性， 降低 MDA 含量和抑制 Caspase-3 蛋白激活等方式抑制 MPTP 誘導的 氧化應激反應。本研究發現，MPTP 可以使大鼠學習記憶能力顯著下降，而 TRPV1 阻滯劑 AMG9810 則可以明顯改善這種學習記憶能力的損傷，該作用可能與 AMG9810 可以通過降低 MPTP 誘導的氧化應激反應有關。這為將來 AMG9810 用于PD治療提供了理論基礎。