納米功能材料在血栓診療領域的研究進展

李博，楊童，劉錦，蔣鵬，周倩

(1.廣東藥科大學中醫藥研究院，廣州 510006； 2.暨南大學生命科學學院，廣州 510632； 3.中國醫學科學院輸血研究所，成都 610052)

血栓性疾病(如心肌梗死、腦卒中、肺栓塞)的前期癥狀隱匿、治療窗口期短，致死率高居全球疾病的首位[1-4]。隨著全球人口老齡化進程的加快，血栓性疾病發病率逐年上升，給社會及患者帶來巨大的經濟負擔。血栓形成的主要生理功能是預防血管損傷引起的出血，同時加速止血；在后期愈合階段，血栓斑塊能在內源性組織型纖溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activator，tPA)的作用下被逐步溶解，實現血管再通暢[5]。在病理狀態下，血栓始于動脈粥樣硬化斑塊剝離等偶發事件，伴隨著剝離斑塊的隨機附著，新發微血栓形成并迅速增長，但往往在機體調控溶栓之前已導致毀滅性臨床事件[6-7]。因此，早期診斷和有效溶栓是提高血栓性疾病治療效果的關鍵。

目前，影像學技術僅能識別晚期血栓而無法準確檢測急性新發血栓，嚴重制約了血栓性疾病治療窗口期；此外，臨床溶栓主要依賴肝素、tPA、重組tPA、尿激酶型纖溶酶原激活物和鏈激酶等，這些蛋白質類藥物在體內具有半衰期短、免疫原性高、易失活等特點，且采用全身給藥，易誘發腦出血等并發癥，危及生命[8]，故嚴重困擾著血栓性疾病的臨床診斷與治療。近年來，納米技術在血栓性疾病早期診療方面取得了令人矚目的成果。現就納米材料在血栓診斷及溶栓治療方面的最新研究進展，及其現存問題和臨床轉化前景進行綜述。

1 血栓分子機制

血栓性疾病主要由血管內血栓阻塞血液流動而導致的局部缺血引起。依據血栓形成的部位分為動脈血栓和靜脈血栓，動脈血栓主要由大量血小板和少量纖維酶原蛋白及紅細胞在高剪切力血流下形成；靜脈血栓則由少量血小板、纖維酶原蛋白和大量紅細胞在低剪切力血流下形成。

前期研究發現，動/靜脈血栓形成及演進均涉及3個主要階段：①血小板黏附在血管內壁病灶區域(內壁破損點、炎癥部位及膠原蛋白暴露點等)并被激活，其表面高表達P-選擇素等受體分子；②活化血小板同時改變其表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa，又稱整合素αⅡbβ3，提高其與纖維蛋白原的結合，進而快速形成聚集塊；③凝血酶原在凝血瀑布級聯放大作用下轉變為凝血酶，進一步將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白，后者交聯組裝形成不溶性的血栓斑塊[9-12]。上述各階段所涉及的關鍵分子使設計出血栓特異性靶向結合體系成為可能。近20年來，納米技術的蓬勃發展為多種疾病的精準診斷及藥物靶向遞送研究帶來了希望，其在血栓診斷與溶栓治療方面也取得了重要進展。

2 納米材料用于血栓診斷

大多數血栓性疾病患者在發病前幾乎無明顯的臨床癥狀，早期準確診斷血栓性疾病能有效延長治療窗口期，為及時采取有效溶栓策略創造條件，從而避免后期發生危及生命的嚴重臨床事件。然而，現階段的臨床影像技術仍無法對早期血栓進行診斷。隨著納米技術的飛速發展，通過開發靶向血栓標志物提高病灶區域造影信號的分子影像探針的研究不斷展開。

2.1磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI) 磁性納米體系因其獨有特性而被作為MRI造影對比劑。前期研究證實，褐藻糖膠能與活化血小板表面的P-選擇素特異性結合[13]。將褐藻糖膠與超小型順磁氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide,USPIO)納米顆粒(nanoparticles,NPs)偶聯，可獲得彈性蛋白酶誘導大鼠腎下主動脈血栓模型的血栓病灶MRI[14]。Liu等[15]將能與血小板表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa特異性結合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸環肽(cyclic arginine-glycine-aspartate，cRGD)偶聯到聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]修飾過的四氧化三鐵(Fe3O4)-NPs上，實現大鼠腹主動脈血栓造影成像。Ta等[16]將可剝離的釓(Gd)層用能被凝血酶特異性裂解的短段(ThrPep)偶聯到氧化鐵納米表面，并進一步用纖維蛋白結合肽修飾納米結構，得到血栓MRI多功能納米傳感器；該體系能夠依據血栓形成時間及病灶凝血酶含量而特異性釋放Gd，從而呈現MRI中T1、T2造影信號的切換，實現血栓類型的準確診斷。Li等[17]通過“點擊反應”將能與血小板表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa特異性結合的單鏈抗體偶聯到表面修飾有化學熒光基團的NaGdF4-NPs上，證實該結構具有優異的生物相容性，能快速靶向富集到活化血小板，實現血栓MRI和熒光雙模成像。

2.2CT 臨床上，CT難以區分血栓結構及循環系統中的血液組分，因此無法實現精準診斷。一些含有高Z元素的組分，包括金(Au)、鉍(Bi)、鋯(Zr)、碘(I)等具有很強的X射線吸收能力，可作為CT成像造影劑。乙二醇殼聚糖修飾的Au(GC-Au)NPs可聚集在血栓部位增強病灶CT造影信號[18]。纖維蛋白結合肽進一步修飾GC-AuNPs表面得到功能化fib-GC-AuNPs，其能在小鼠頸動脈血栓及腦卒中模型中快速靶向并富集到病灶部位，顯著增強血栓CT造影信號，實現血栓的快速診斷[19]。Kwon等[20]設計了凝血酶響應的近紅外熒光和CT雙模成像分子探針(TAP-SiO2@AuNPs)，其在血栓病灶富集后能特異性地提供近紅外熒光/CT雙重造影信號，從而實現早期血栓精準診斷。Koudrina等[21]將能夠特異性靶向纖維蛋白原的適配子分別與I-NPs及Au-NPs偶聯得到I-FA和FA-AuNPs兩種靶向分子探針，兩者均可在血栓處富集并增強病灶CT成像效果；而FA-AuNPs主要富集在血栓表面，I-FA能夠滲透進入血栓內部，從而提供整個血栓區域的CT造影信號，這可能是由于不同粒徑及形貌特征I-NPs及Au-NPs對NPs擴散性的影響所致。

2.3超聲及光聲成像 超聲因快速(實時監測)、安全(非侵襲、無放射)、廉價等優點被視為臨床疾病診斷的首選輔助檢查。但血管內循環組分，如紅細胞、血小板等具有較高的超聲背景信號，極大地限制了血栓病灶的準確診斷。前期研究發現，微氣泡能顯著增強超聲造影信號，可將能與血栓特異性靶向結合的分子修飾到微氣泡表面，有望克服血流剪切力，使微氣泡富集在血栓部位，從而提高病灶區域的超聲造影信號[22]。Li等[23]將聚合物微泡與褐藻糖膠偶聯得到褐藻糖膠微泡，證實其能在大鼠下腔靜脈血栓靶向富集并增強病灶區域的超聲造影信號。Wang等[24]將能與活化血小板表面糖蛋白Ⅱb/Ⅲa結合的單鏈抗體與微泡偶聯，獲得靶向微泡，并證實靶向微泡可實現小鼠頸動脈血栓的快速成像，并能夠實時監測血栓體積、評價溶栓治療效果。

光聲成像是一種新興的生物醫學成像方式，主要通過檢測組織或造影劑吸收特定激光后產生的超聲信號，實現體內特定區域的成像技術。Cui等[25]利用兩性分子二萘嵌苯-3,4,9,10-四羧酸二酰亞胺(perylene-3,4,9,10-tetracarboxylic diimide，PDI)自組裝成NPs，并用cRGD進一步修飾得到具有較好光聲造影性能的功能化分子探針cRGD-PDI；在小鼠模型中，cRGD-PDI能夠依據血栓形成時間提供不同光聲信號，實現新老血栓的區別監測。Jung等[26]開發了過氧化氫觸發的T-FBM(thrombus-specific the-ranostic)-NPs，其可被血栓微環境獨有的過氧化氫激活生成CO2，進而放大病灶區域光聲信號，實現血栓特異性成像。Zhang等[27]將Fe3O4-NPs、墨汁、PLGA共同封裝入聚多巴胺納米殼中，并在其表面共修飾cRGD和P-選擇素特異性結合肽沒食子酸修飾的EWVDV，獲得雙靶向功能納米體系，結果證實，雙靶向設計顯著提高了高血液剪切力下納米體系靶向結合血栓的能力，并能提供病灶區域光聲成像/MRI造影信號。

2.4光學/熒光成像 隨著光學納米探針的飛速發展，紫外線、可見光、紅外線、熒光等光學設備在血栓診斷領域的應用引起了廣泛關注。Gerstenhaber等[28]設計了一系列熒光納米金剛石顆粒(fluorescent nanodiamond particles，F-NDP)，隨后與Bit(Bitistatin)偶聯形成功能化的近紅外探針F-NDP-Bit，其能與活化血小板上的纖維蛋白原受體特異性結合，實現血栓的紅外成像。此外，Bonnard等[29]以介孔二氧化硅為模板，利用賴氨酸(K)和聚谷氨酸(E)將具有高度親水性的脯氨酸(P)、丙氨酸(A)和絲氨酸(S)交聯構成具有高度生物安全性的納米結構PASKE，其在循環系統中具有較長滯留時間，且極易被溶酶體降解；與單鏈抗體和熒光染料偶聯的PASKE能在小鼠頸動脈血栓處靶向富集并呈現病灶熒光信號。盡管分子探針的發展給血栓的光學/熒光成像帶來新的機遇，但外源光線組織穿透性差等因素限制了其現階段的應用，目前其僅用于檢測近表層血栓，未來近紅外二區成像的分子探針的開發將有望實現深層血栓的精準診斷。

3 納米材料用于溶栓治療

目前，納米載體在延長藥物循環時間及實現體內病灶靶向富集方面已取得令人矚目的成績。與腫瘤等疾病的遞送系統相比，靶向血栓藥物的遞送路徑更直接，遞送效率更高[30-32]。但體內血栓病灶往往處于血流高速剪切力環境下，這對納米體系的靶向結合能力提出了更高的要求[33]。

3.1脂質體納米材料 脂質體納米的生物相容性較高，被認為是最具前景的納米藥物遞送系統之一，目前一些產品已被批準臨床使用。Zhang等[34]將cRGD與脂質體NPs偶聯構建了血栓靶向遞送系統，其負載尿激酶能夠提升4倍左右的溶栓效果，且出血風險顯著降低。Huang等[35]證實，cRGD修飾的聚乙二醇功能化脂質體負載重組tPA后能與活化血小板結合，并在血栓區域富集，隨后通過膜融合實現重組tPA在血栓部位的加速釋放，進而快速溶解血栓。Rassam等[36]以固體脂質體為載體，通過詳細研究不同反應配比下的重組鏈激酶負載率獲得實現最大負載率的條件，為工業化制備脂質體溶栓藥物奠定了基礎。盡管脂質納米載體在溶栓領域取得了一定成績，但其臨床應用仍有待進一步研究。

3.2聚合物納米材料 目前，以多糖(透明質酸、葡聚糖、殼聚糖等)天然聚合物和聚乙烯、氰基丙烯酸異丁酯、PLGA、聚乙二醇、聚吡咯(poly pyrrole，PPY)等合成聚合物為基礎的納米遞送系統受到廣泛關注。上述合成聚合物NPs具有制備簡單、結構均一、重現性好、便于后期功能化修飾等優點。Sivaraman等[37]以十二烷基二甲基溴化銨或聚乙烯醇為表面活性劑構建了可負載10 μg重組tPA的PLGA納米結構，證實其可通過緩釋重組tPA抑制動脈瘤的進一步增生。Juenet等[38]構建了由氰基丙烯酸異丁酯交聯褐藻糖膠及葡聚糖形成的納米結構，負載重組tPA后，在靜/動脈剪切力下，其通過結合P-選擇素富集于血栓病灶，達到快速溶栓的目的。Colasuonno等[39]將PLGA和聚乙二醇聚合構建了仿紅細胞的盤狀聚合物納米結構(discoidal polymeric nanoconstructs，DPNs)，并將tPA分子與DPNs表面的羧基共價連接得到tPA-DPNs，仿紅細胞結構tPA-DPNs使tPA分子快速富集到血栓部位，實現高效溶栓。Lu等[40]將能與P-選擇素結合的肝素及酸敏感的乙二醇殼聚糖修飾到PPY-NPs上得到具有雙靶向功能的GCS-PPY-H NPs，其可靶向酸性/P-選擇素高表達的血栓病灶區域，并通過近紅外光輻射熱療啟動病變部位特異性溶栓，達到光熱溶栓效果。

3.3無機納米材料 無機納米材料因其獨特的磁、熱等特質，在多種疾病的診療領域受到廣泛關注。現階段，無機材料在血栓治療領域的研究主要集中在溶栓藥物的體外控釋方面。Hu等[41]設計了載有tPA的多孔磁性氧化鐵微棒，其可在外部磁場引導下靶向腦部血栓，隨后tPA在栓塞部位緩慢釋放；同時，施加外部旋轉磁場可使載有tPA的多孔磁性氧化鐵微棒實現微擾動，機械破壞血栓結構，增加tPA滲透性，從而實現快速溶栓。Wang等[42]將尿激酶通過肉豆蔻醇固定到含金介孔二氧化硅納米球上，其富集在血栓病灶后，在近紅外光輻照下，金納米吸收光能轉變為熱能，使肉豆蔻醇轉變為液相，進而達到緩釋尿激酶的目的，結果顯示，37 ℃時尿激酶釋放效率僅為10.5%，而39 ℃時尿激酶釋放效率高達89.5%。Fu等[43]構建了含硫化銅的介孔二氧化硅-NPs，其擁有出色的光熱轉換效率和尿激酶型纖溶酶原激活物負載率；經近紅外光輻照觸發硫化銅光熱轉換后，尿激酶型纖溶酶原激活物的釋放顯著增強，體內模型驗證結果顯示，含硫化銅的介孔二氧化硅-NPs在近紅外光輻照下的溶栓效果較好。Deng等[44]將血栓靶向肽CREKA(Cys-Arg-Glu-Lys-Ala)修飾到載有一氧化氮供體分子BNN6的聚多巴胺空心納米表面得到功能NPs——B@P@C，其在血栓部位富集后，聚多巴胺在近紅外光輻照下將能量轉移至BNN6，進而觸發一氧化氮氣泡釋放，達到機械溶栓效果，同時一氧化氮還能防止血小板再凝集，并可進一步擴張血管，避免血栓復發；B@P@C在一定程度上實現了血栓非藥物治療，避免溶栓藥物引發的副作用，為臨床溶栓治療提供了全新策略。

3.4仿生納米材料 傳統納米材料的臨床應用面臨生物相容性、免疫原性、器官毒性等問題。受生物結構啟發的納米仿生技術不僅可有效偽裝NPs，從而躲避免疫清除并降低其機體毒性，同時也能實現部分原有生物結構的功能。作為一種新興納米遞送體系，仿生納米材料的研究具有廣闊的臨床應用前景。血栓診療領域的仿生納米主要通過模擬血栓主要成分(紅細胞和血小板)靶向血栓。Vankayala等[45]將吲哚菁綠及近紅外顯像劑封裝到紅細胞膜納米結構中，并通過胺醛將重組tPA偶聯到該納米結構上，形成血栓仿生納米診療體系，其可用于溶栓治療，并可通過熒光實時監控血栓變化。Xu等[46]將血小板膜剝離后的偽裝PLGA-NPs與重組tPA偶聯得到仿血小板的納米結構，該結構在體內循環中具有與血小板相似的生理行為，其循環時間較未修飾PLGA-NPs明顯延長，且具有類似于血栓部位血小板主動富集的生理行為，其治療的肺栓塞小鼠的血栓面積明顯低于相同劑量重組tPA治療小鼠，溶栓效果明顯提高。為應對腦部血栓阻塞和隨后局部缺血誘發的缺血性腦卒中，研究人員設計合成了人造“納米血小板”，通過凝血酶響應肽將Tat與重組tPA偶聯，隨后將其與神經保護劑(ZL006e)共負載于乙縮醛葡聚糖聚合NPs上，再用血小板膜包被納米結構得到順序靶向釋放的功能納米平臺tP-NP-重組tPA/ZL006e；其通過類血小板生理行為富集到腦血栓部位后，在凝血酶作用下重組tPA與Tat分離執行溶栓功能，暴露的Tat可促進NPs穿過血腦屏障并進入缺血腦組織，從而實現ZL006e的定點遞送與釋放[47]。與其他納米結構相比，仿生遞送體系的生物安全性更高、體內滯留時間更長，這為納米溶栓載體設計提供了新的方向。

4 小 結

現階段，納米體系在血栓診療領域的研究取得了一些進展，但其臨床轉化應用仍面臨一系列問題。體內血流的高速剪切力仍是納米體系在血栓病灶實現高效靶向富集的最大障礙，且體內血流的高速剪切力還直接影響納米材料在血栓部位的滯留時間，進而影響溶栓效果；此外，納米載體本身的生物相容性、器官累積毒性及誘發的免疫反應仍有待進一步研究；納米載體上溶栓藥物泄露所誘發的副作用也應重點關注；新近發展的仿生納米技術雖然克服了一些常規納米體系的缺陷，但其重現性以及放大生產的可能性尚不明確。總之，納米功能體系為血栓類疾病的早期精準診斷與治療開辟了新的方向，未來可能為疾病治療帶來更多選擇和希望。