活性氧類在慢性牙周炎所致骨吸收中的研究進展

袁一方，陳曉濤

(1.新疆醫科大學，烏魯木齊 830002； 2.新疆維吾爾自治區人民醫院口腔科，烏魯木齊 830001)

牙周炎是一種以牙周組織炎癥反應為特征的慢性感染性疾病，其發病無地域、民族和年齡差異，近年牙周炎的發病率逐年升高[1]。牙周炎主要由菌斑微生物引發的宿主免疫反應引起，病情逐漸進展，最終引起機體牙齒支持組織的漸進性破壞[2]。牙周炎的發病機制主要與一些具有高蛋白酶和免疫抑制特性的宿主微生物有關，如常見的牙齦卟啉單胞菌。牙周炎的發病機制復雜，隨著近年口腔醫學的發展，認為牙周炎還可通過一些復雜的生物及信號因子激活某種通路，最終損傷牙周組織。牙周炎是導致成人牙齒損傷甚至缺失的主要原因，在諸多牙周炎的發病機制中，過量活性氧類(reactive oxygen species,ROS)產生的氧化應激而造成的骨破壞成為目前牙周炎骨吸收的研究熱點[3]。研究證實，牙周組織的損傷多由白細胞、補體和ROS參與的宿主免疫反應導致，機體在啟動宿主免疫反應后，中性粒細胞成為牙周組織和齦溝中最常見的炎癥細胞，通過由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)促進的呼吸鏈代謝途徑產生過氧化氫、超氧陰離子和羥基自由基[4]，上述物質統稱為ROS。在生理條件下，大部分ROS經細胞內線粒體呼吸鏈途徑產生，機體產生的抗氧化劑能有效中和ROS或修復ROS誘導的組織損傷，從而抵消氧化應激的有害作用。當炎癥發生時，ROS產生急劇增加，高水平或高活性的ROS不能被抗氧化防御系統平衡，過剩的ROS導致氧化應激和組織損傷[5-6]。相關研究表明，過量ROS堆積對牙周組織的損傷過程主要分為兩個途徑：①ROS可直接引起組織損傷，涉及脂質過氧化、DNA損傷、蛋白質損傷和重要酶的氧化；②ROS可作為信號分子或炎癥介質激活相關信號通路，引起炎癥反應和組織損傷[6]?，F就過量ROS產生的氧化應激在牙周炎骨吸收中的相關信號通路予以綜述，以期為進一步明確ROS與牙周炎的病理機制提供依據，并為牙周炎治療提供思路。

1 ROS與氧化應激

氧化應激是指體內游離基代謝障礙導致的氧化與抗氧化系統失衡[7]，該失衡狀態更趨向于氧化作用。氧化應激可導致機體產生大量的氧化中間產物，從而引起組織損傷。相關研究證實，過量ROS累積是導致機體發生氧化應激的直接因素，ROS在氧化應激過程中是調節細胞生長、分化、衰老和凋亡的信號分子[8]。ROS作為體內氧的還原代謝產物，具有強氧化能力，在正常生理條件下，ROS和抗氧化劑之間呈平衡狀態，兩者共同構成完整的抗氧化系統。機體因炎癥刺激等因素持續產生過量的ROS，進而導致抗氧化系統失衡，引起氧化應激，造成機體細胞內脂質過氧化、DNA和蛋白質損傷以及相關的酶氧化[9]，從而激活相關信號通路，加重炎癥反應，最終導致組織損傷。目前已知的ROS激活氧化應激的相關途徑主要有核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路、核轉錄因子紅系2相關因子2(nuclear factor-erythroid2-related factor 2，Nrf2)/Kelch樣ECH相關蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein-1，Keap1)信號通路、促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路等。目前關于ROS與氧化應激之間機制的研究較多，但是缺乏大量循證醫學證據。機體的氧化還原平衡處于不穩定狀態導致ROS過量累積，促使機體出現氧化應激反應，而牙周組織中的氧化應激反應也基于上述信號通路，因此，進一步探究牙周組織中ROS與氧化應激之間的病理機制，可為牙周炎治療奠定理論基礎。

2 牙周炎與ROS

近年來，ROS與牙周炎的關系逐漸受到關注。在牙周炎的病理進程中，中性粒細胞是抗牙周致病菌的第一道防線[10-11]，在病原體的刺激下，中性粒細胞通過NOX促進的呼吸鏈代謝途徑產生超氧陰離子，并將其釋放到噬菌體和細胞外環境中，轉化為不同的自由基和非自由基衍生物，如過氧化氫、羥基自由基、次氯酸和單線態氧；在病原生物膜啟動宿主反應后，中性粒細胞是牙周組織和齦溝中最常見的炎癥細胞，被認為是牙周炎中ROS的主要來源[12]。因此，牙周組織中炎癥反應與ROS之間的關系受到關注，研究發現，牙周炎患者血清、唾液以及齦溝液中ROS代謝物含量增加，總氧化狀態水平升高[13]，且牙周炎患者外周血中性粒細胞中ROS的活性高于健康個體[14]。另有研究表明，即使沒有任何刺激，牙周炎患者中性粒細胞釋放的細胞外ROS亦多于健康對照組[15]。Shaheen等[16]發現，牙周炎患者齦溝液中的氧化應激標志物水平與牙周袋探診深度、齦溝出血指數及附著水平呈正相關，經牙周治療后，患者機體的氧化應激標志物水平改善。Tamaki等[17]指出，經牙周基礎治療后，牙周炎患者血清ROS水平及牙周指標均較治療前明顯降低，證實牙周炎相關臨床參數與ROS存在相關性。Zeidán-Chuliá等[18]對健康人、牙周炎以及牙周炎并發糖尿病患者牙齦組織的免疫組織化學分析顯示，牙周炎患者牙齦組織中基質金屬蛋白酶7的表達與ROS活性升高相關。相關研究發現，ROS可以提高基質金屬蛋白酶的活性，并進一步刺激牙周膜成纖維細胞分泌白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β等產生相關炎癥反應，加劇破骨細胞分化，最終破壞牙周組織，甚至導致牙齒脫落[19]。綜上，ROS與牙周炎發生發展關系密切，進一步完善牙周炎與ROS之間的機制研究能夠為牙周炎的預防和治療提供一定的理論依據。

3 ROS與牙槽骨吸收

牙槽骨是牙周組織的重要成分，當各種病理因素導致牙槽骨吸收時，牙齒的支持組織喪失，進而出現牙齒松動，最終導致牙齒脫落。過量ROS堆積被認為是牙周炎中骨破壞性疾病的促進因素之一，ROS介導細胞內信號分子生成破骨細胞是牙槽骨吸收的關鍵。骨穩態可維持成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收之間的平衡，來源于骨髓單核/巨噬細胞系的破骨細胞，通過一系列增殖、分化和融合，最終發育為成熟且唯一能吸收礦化骨的多核巨細胞。成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收之間的平衡主要經核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)/核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)/骨保護素信號通路轉導，從而維持骨穩態；作為環路調節系統，RANKL/RANK/OPG信號通路通過調節破骨細胞活化參與骨重建，發揮關鍵作用[20]。另有研究發現，ROS可激活NF-κB信號通路并促進IL-6、IL-1β、IL-1、IL-2、腫瘤壞死因子-α、前列腺素E2和淋巴毒素等的分泌，上述細胞因子及趨化因子與牙周組織的骨吸收有關，其中前列腺素E2是牙周骨吸收最有力的刺激因素；IL-1和腫瘤壞死因子-α在牙周炎中能啟動組織破壞和骨吸收；IL-1是骨脫礦的最有效誘導因素；IL-6可刺激破骨細胞分化和骨吸收，并抑制骨形成；而涉及破骨細胞形成的關鍵因子包括RANKL、腫瘤壞死因子受體相關因子6和NOX等，且NOX同源物NOX1和NOX2可在破骨細胞形成過程中相互作用并產生ROS[21]。綜上，ROS除可直接引起組織損傷外，還可在破骨細胞形成過程中發揮間接作用，導致牙周骨組織變性。

ROS可通過激活NF-κB信號通路導致牙槽骨吸收，在牙周炎病程進展中起重要作用。ROS信號通路還可促成MAPK、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)和NF-κB的活化[22]，NF-κB是第一個對ROS應答的轉錄因子[23]，可介導NF-κB抑制蛋白α的磷酸化及降解。使用抗氧化劑預處理破骨細胞可抑制其氧化，并降低由RANKL誘導的蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)、NF-κB、胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)的活化[24]，證實ROS在牙周骨破壞中起關鍵作用。另有研究發現，應用抗氧化劑激活MAPK級聯反應可抑制破骨細胞前體對RANKL的反應[25]，由RANKL介導的ROS可誘導Ca2+的持續振蕩，從而激活活化T細胞核因子c1[26]，促使破骨細胞形成，進一步導致牙周骨破壞。此外，Nrf2可啟動多種抗氧化酶，從而降低ROS引起的牙周損傷。由此可見，ROS在牙周炎進程中發揮重要作用，可通過NF-κB、MAPK以及Nrf2等信號通路介導破骨細胞活化，進而導致牙周骨組織及軟組織破壞。

3.1ROS和NF-κB信號通路 NF-κB是炎癥的主要調節因子，也是第一個被發現的對ROS應答的轉錄因子，可調控數百個與免疫反應相關基因的表達，在氧化應激與炎癥的調節中具有重要地位。在牙周炎導致的骨炎癥狀態下，淋巴細胞大量產生RANKL[27]，RANKL是破骨細胞生成必不可少的因素之一，可作用于RANK受體，誘導腫瘤壞死因子受體相關因子6募集，進而激活多個下游靶點，包括MAPK和NF-κB通路，導致活化T細胞核因子c1的c-Fos和核因子活化[28]。被激活的NF-κB還能促進趨化因子及促炎因子的分泌，進而導致炎癥反應和牙周破骨細胞分化，最終造成牙周組織破壞[19]。在破骨細胞形成和骨吸收過程中，細胞內ROS起到至關重要的作用，RANKL刺激破骨細胞前體發生腫瘤壞死因子受體相關因子6/Ras相關C3肉毒毒素亞基1/NOX1級聯反應，促進細胞內ROS生成[26]。Lee等[25]研究發現，抗氧化劑(如乙酰半胱氨酸)或NOX抑制劑(如二苯碘銨)可通過抑制RANKL介導的ROS生成抑制破骨細胞生成，表明ROS是破骨細胞分化所必需的。綜上，牙周組織中過量的ROS通過激活NF-κB信號通路過度表達相關細胞因子，進而上調破骨細胞活性，最終導致牙周骨質破壞。

3.2ROS和MAPK信號通路 MAPK信號通路由ERK1/2、c-Jun氨基端激酶、p38激酶和大MAPK1/ERK5通路組成，是細胞各種生命進程中發揮重要作用的主要細胞內信號轉導通路[29]。Lee等[25]研究表明，ROS、c-Jun氨基端激酶、p38、ERK1/2的激活可介導RANKL刺激的破骨細胞分化，表明NOX1產生的超氧化物陰離子也參與了破骨細胞分化過程。過氧化氫處理的原代成骨細胞和骨髓間充質干細胞可刺激ERK1/2磷酸化以及磷脂酶Cγ1和ERK依賴的NF-κB活化，導致成骨細胞分化受損[30]。Bai等[31]的研究表明，ERK激活可介導ROS誘導的RANKL表達。而Ohyama等[32]研究證明，RANKL能誘導ERK和c-Jun氨基端激酶的活化并促進ROS的生成，且ROS可激活c-Jun氨基端激酶信號通路，促進炎癥因子生成，造成牙周組織破壞。由此可見，ROS參與MAPK信號通路，在牙周組織炎癥反應中發揮重要作用。

3.3ROS和Nrf2信號通路 Nrf2可與靶基因啟動子近端的抗氧化反應元件結合，調控轉錄啟動多種抗氧化酶的表達，以抵抗ROS堆積導致的牙周損傷，保護細胞功能。組織發生應激損傷后，被激活的Nrf2易位到細胞核并上調抗氧化酶的表達，包括過氧化氫酶、谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基以及超氧化物歧化酶。隨后，Nrf2通過啟動抗氧化酶表達，降低細胞內ROS水平，進而抑制MAPK通路和PI3K/Akt通路以及破骨細胞分化[33]。如Nrf2通過調節抗氧化酶的表達降低細胞內ROS水平，進而抑制RANKL介導的小鼠破骨細胞生成及骨破壞[34]。Zhu等[35]的體內及體外實驗發現，黃芩素(具有抗氧化和免疫調節作用)可通過Nrf2信號通路減輕氧化應激損傷，并改善牙周炎所致的牙槽骨吸收。在RANKL誘導的破骨細胞分化過程中，RANKL通過上調Keap1降低Nrf2/Keap1表達水平，進而提高細胞內ROS水平，促進破骨細胞的分化和功能[36]。故推測，抗氧化劑可作用于ROS/Nrf2/Keap1信號通路，發揮維持骨穩態的作用。

3.4其他信號通路 在牙周炎的骨吸收反應機制中，除NF-κB、MAPK、Nrf2等信號通路外，ROS還參與其他信號通路的調控。Mukherjee和Rotwein[37]發現，PI3K下游Akt信號通路是骨骼代謝中的重要信號轉導通路，在細胞增殖、分化和礦化中均起關鍵作用，且Akt的磷酸化水平是成骨細胞成骨分化的指標[38]。此外，PI3K/Akt通路的激活也可作為氧化應激的負性調節劑[39]，從而導致牙周骨炎癥進一步發展。研究表明，糖尿病患者更易并發牙周炎，可能與高葡萄糖誘導的氧化應激抑制了成骨分化及PI3K和Akt磷酸化的表達相關[40]。牙周炎的發病機制復雜，ROS可干擾細胞內和細胞間的多種信號通路，并涉及多種機制，如炎癥調節、蛋白質代謝、細胞增殖分化，仍需要進一步的研究探討。

4 小 結

牙周炎的骨組織破壞與過量ROS堆積引起的氧化應激相關，ROS參與了多種牙周骨吸收信號通路，被認為是牙周炎等疾病的驅動因素之一。牙周組織內ROS過度堆積會產生氧化應激反應，刺激多種細胞因子及趨化相關因子產生，通過激活NF-κB、MAPK以及Nrf2等信號通路，導致細胞功能障礙，最終促使牙周骨破壞，甚至出現牙齒脫落。因此，研究ROS調節牙周炎介導骨吸收相關信號通路的機制對于明確相關靶點有效治療策略至關重要。然而，ROS在介導骨代謝中有多種功能，且無法單獨評估骨骼中成骨細胞、破骨細胞的ROS水平，故需通過了解骨細胞分化過程中ROS的水平認識ROS在骨骼中的作用。ROS參與的相關信號通路具有高度復雜性，現有研究并未闡明ROS在牙周炎導致的骨吸收機制中的確切作用，隨著研究的不斷深入，ROS在牙周炎中的作用及機制逐漸清晰，將為牙周炎的防治提供更多方法。