線粒體在腎臟缺血再灌注損傷中的作用與機制

葉芃，程帆

(武漢大學人民醫院泌尿外科，武漢 430060)

腎臟除凈化血液外還具有維持機體穩態的多種重要功能，如調節酸堿及電解質平衡、血壓、營養物質的重吸收和激素分泌[1]。在靜息狀態下腎臟每分鐘需濾過1 000～1 200 ml血液以維持機體穩態，因此腎臟是機體耗能量最大的臟器，其耗氧量占人體總耗氧量的10%，其線粒體含量也是人體各臟器中最高的[2]。因此，線粒體與腎臟的正常生理功能密切相關，線粒體損傷及功能障礙被認為是多種急性和慢性腎臟病的主要致病因素，如糖尿病腎病、高血壓腎病、梗阻性腎病、缺血性腎損傷、藥物性腎損傷、感染性腎損傷、腎腫瘤和部分遺傳性腎病的發病和進展[3-4]。

腎臟缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)是導致急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的主要原因之一[5]，外傷、休克、心血管手術、敗血癥及腎移植等因素均是腎臟IRI發生的誘因。據統計，AKI在所有住院患者中的發病率為2%～7%，而在重癥監護病房中AKI的發病率甚至超過10%，病死率高達50%，對患者生命安全造成極大威脅[6]。而在腎移植過程中，IRI可導致移植腎功能恢復延遲，誘導急性排斥反應甚至進展為慢性移植腎腎病[7-8]。IRI導致的AKI常因伴隨炎癥、異常修復及纖維化等一系列復雜的病理生理過程而成為慢性腎臟病進展的重要危險因素。近年來，隨著對線粒體研究的逐漸深入，發現線粒體功能在腎臟IRI中起決定性調控作用。現就線粒體在腎臟IRI中的作用與機制予以綜述。

1 線粒體功能與腎臟IRI

作為細胞中ATP的主要來源，線粒體是由具有真核細胞特征的細菌與機體內共生進化而來的半自主細胞器，其通過線粒體氧化磷酸化及三羧酸循環為細胞代謝提供了90%以上的ATP，因此也被稱為“生命的發電廠”。除為機體提供必要的能量外，線粒體還具有維持細胞鈣離子平衡穩態、參與嘧啶和血紅蛋白生物合成、介導細胞生長、維持機體氧化還原狀態、參與細胞增殖和凋亡信號轉導等一系列重要功能。線粒體參與急慢性腎損傷、腫瘤、神經退行性病變、心血管疾病、糖尿病等疾病的發病與進展[9-10]。腎臟IRI的發病機制復雜，包括線粒體功能障礙、內質網應激、缺氧損傷、活性氧類(reactive oxygen species,ROS)的產生、炎癥、凋亡和壞死等因素[11]。腎臟近端小管及髓質中線粒體含量極高，近年來多項研究證實線粒體功能在IRI的發生與進展中起重要調控作用[12-15]。生理狀態下，線粒體通過復雜的調控維持細胞、生物內穩態。而IRI的發生可導致線粒體功能障礙及結構損傷，造成大量ROS產生，進而導致機體能量代謝異常、自噬、凋亡的發生。

1.2腎臟IRI中的線粒體自噬 線粒體自噬是一種特殊形式的自噬，其激活可起到消除多余或受損線粒體的作用。近年的研究表明，線粒體自噬在腎臟IRI導致的AKI中高度活躍且在AKI的進展和隨后的腎臟修復中起重要作用[13,31]。線粒體自噬過程大致可分為4個步驟：①檢測功能障礙的受損線粒體；②受損線粒體從健康線粒體網絡中分離；③吞噬細胞的募集；④通過自噬程序降解受損線粒體。目前機制比較清晰的線粒體自噬由兩大類共4種信號轉導通路介導。①泛素依賴的PTEN誘導假定激酶(PTEN-induced putative kinase,PINK)1-PARK2途徑：在線粒體去極化的條件下，PINK1在線粒體外膜上聚集、磷酸化并將PARK2 E3連接酶招募至線粒體并在線粒體外膜蛋白上構建泛素鏈。泛素化蛋白招募p62/Sequestosome-1等受體蛋白，將泛素標記的線粒體與自噬體膜中的微管相關蛋白輕鏈3連接，導致線粒體自噬體的形成和降解[13]。②非泛素依賴的Bcl-2/腺病毒E1B 19 kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3，BNIP3)/Nip樣蛋白介導途徑、FUN14域蛋白1介導途徑以及心磷脂介導途徑：BNIP3/Nip樣蛋白以及FUN14域蛋白1均是線粒體外膜蛋白，它們可直接將線粒體與自噬體膜中的微管相關蛋白輕鏈3橋接從而形成線粒體自噬體并導致線粒體降解[32-33]。而心磷脂則是一種定位于線粒體內膜的脂質蛋白，通常情況下參與線粒體的代謝，當機體處于氧化狀態時，心磷脂則會重新分布于受損的線粒體外膜表面并與微管相關蛋白輕鏈3進行橋接形成自噬體[34]。線粒體自噬的吞噬作用與線粒體生物發生的再生作用相互協同，進而維持機體內線粒體網絡的健康運行。這種機體的“自我清潔”和“自我再生”機制有效地限制了ROS及凋亡對機體造成的損傷，并且在清除有害突變線粒體的過程中起重要作用。由此可見，線粒體自噬是一種具有高選擇性的自我保護機制，在維持機體內穩態中起關鍵作用。

1.3腎臟IRI中的線粒體途徑凋亡 線粒體功能障礙是介導腎臟IRI后腎小管及細胞壞死和凋亡的重要因素[11]。在哺乳動物細胞中，凋亡主要通過死亡受體和線粒體兩條相互聯系的途徑所引發。線粒體途徑凋亡的主要特點為線粒體外膜通透性受Bcl-2家族蛋白水平失衡的影響而升高，導致細胞色素C等促凋亡因子由線粒體內外流進入胞質。細胞色素C及其他促凋亡因子外流可導致由細胞色素C、凋亡蛋白酶激活因子1和胱天蛋白酶9組成的凋亡小體形成，進而激活胱天蛋白酶級聯反應導致細胞凋亡[12,35]。除缺血再灌注誘導Bcl-2家族蛋白表達水平失衡而引發線粒體途徑凋亡外，ROS也是導致IRI中線粒體途徑凋亡激活的重要因素之一。如前文所述，ROS可通過增加線粒體膜通透性促進線粒體內細胞色素C外溢，間接激活胱天蛋白酶級聯反應[29]。因此，線粒體途徑凋亡是ROS對機體造成損傷的方式之一，線粒體途徑凋亡與ROS密切相關[36-37]。同時，線粒體途徑凋亡也受線粒體自噬水平調控，缺血再灌注導致的線粒體自噬過度也可激活線粒體途徑凋亡，加重IRI[38]。可見，IRI中的線粒體途徑凋亡受多種因素的影響與調控，并最終促進IRI的進展。

2 腎臟IRI中的線粒體功能調控

2.1腎臟IRI中的線粒體ROS調控 基于線粒體ROS導致IRI的機制，可通過多個靶點對腎臟IRI中的線粒體ROS進行調控。多項研究證實，脂溶性醌類化合物及其衍生物對緩解線粒體ROS造成的損傷有良好療效[15,39-40]。化合物MitoQ的主要抗氧化成分泛醌進入線粒體后，通過與ETC復合物Ⅱ相互作用而變性為可清除ROS的活性抗氧化劑泛醇。泛醇與ROS相互作用后被還原為泛醌，并再次與ETC復合物Ⅱ發生相互作用而被激活為泛醇。這一過程使MitoQ能有效清除機體內過量的ROS[41]。有研究表明，在局部缺血發作前給予MitoQ可以有效降低氧化損傷和腎臟IRI的程度，起到保護腎功能的作用[42]。Skulachev等[43]則合成了醌類化合物SkQ1，其主要成分為質體醌基-癸基-三苯基膦，在體外實驗中，SkQ1可提高腎小管上皮細胞的存活率，并減少缺氧/復氧誘導的線粒體分裂。在單側腎缺血再灌注的大鼠實驗模型中，在腎缺血前1 d對大鼠注射SkQ1可顯著提高其存活率[43]。Plotnikov等[44]研究發現，醌類化合物SkQR1可使腎缺血再灌注大鼠的腎臟線粒體ROS及脂質過氧化水平恢復正常，并有效降低大鼠的血尿素氮、血清肌酐水平，提高大鼠的存活率。此外，SkQR1還可誘導促紅細胞生成素的生成和糖原合成酶激酶-3β的磷酸化。促紅細胞生成素對組織的缺血性損傷有一定的保護作用，而糖原合成酶激酶-3β的磷酸化與促生存基因活性相關，糖原合成酶激酶-3β的磷酸化可阻止線粒體膜通透性改變，恢復線粒體膜電位，并減少ROS的產生[44]。

mPTP作為IRI藥物干預的另一個潛在靶點已在心肌缺血領域得到應用[45]。阻斷mPTP開放在再灌注早期可保護線粒體結構和代謝，促進ATP的恢復。親環蛋白D是mPTP的組成部分，研究表明敲除親環蛋白D基因或應用親環蛋白D抑制劑環孢素A可減輕IRI大鼠的腎損傷[46]。雖然環孢素A的腎毒性特征不適用于腎臟IRI的治療，但其中的抗IRI機制仍極具研究價值。由于氧化應激程度既取決于ROS的產生水平，也取決于SOD對ROS的清除作用，在缺血再灌注過程中使用SOD模擬物拮抗ROS可能會減輕腎臟IRI。錳(Ⅲ)-四(4-N-甲基吡啶基)卟啉是一種具有清除過氧亞硝酸鹽作用的SOD模擬物，可通過減少缺血再灌注后腎小管近端區域組織的脂質過氧化，降低硝基酪氨酸水平、胱天蛋白酶3活化程度和減輕腎小管上皮細胞損傷而發揮腎臟保護作用；此外，錳(Ⅲ)-四(4-N-甲基吡啶基)卟啉還可通過降低促凋亡基因Bax和FasL的表達而抑制死亡受體和線粒體途徑凋亡[47]。

綜上所述，通過減少線粒體ROS來減輕腎臟IRI的治療方式具有一定的臨床應用價值，通過促進泛醇類抗氧化物生成、調節線粒體膜通透性及補充外源性SOD等方式均可起到減少線粒體ROS生成并保護腎臟的作用。雖然上述研究成果大多尚未實際應用于腎臟IRI的治療，但已在心臟IRI等領域臨床應用并取得了良好的療效。相信隨著臨床試驗的不斷完善，未來將會出現更多基于調控線粒體ROS機制的腎臟IRI治療方案。

2.2腎臟IRI中的線粒體自噬調控 腎臟缺血再灌注可導致腎小管細胞中的線粒體自噬顯著增加，在腎臟近端小管細胞中尤為明顯。Ishihara等[48]研究表明，在腎臟IRI期間BNIP3以缺氧誘導因子-1α依賴途徑上調，同時過表達BNIP3可增加線粒體自噬水平，而敲低BNIP3則對線粒體自噬起到抑制作用，表明腎臟IRI過程中存在BNIP3依賴的線粒體自噬途徑。Fu等[49]則進一步證明在腎臟IRI模型中敲低缺氧誘導因子-1α可通過BNIP3途徑減少腎臟中線粒體的自噬通量從而加重ROS和細胞凋亡，導致腎臟IRI加劇。Tang等[50]從另一方面證實，BNIP3表達水平在缺氧/復氧培養的腎小管細胞及腎臟IRI小鼠模型中均顯著升高，而BNIP3缺乏會抑制線粒體自噬水平，導致受損線粒體累積、ROS增多、炎癥反應增強以及腎小管細胞死亡，從而加重腎臟IRI。PINK1-PARK2途徑依賴的線粒體自噬在腎臟IRI過程中同樣發揮保護作用。有研究揭示了PINK1和PARK2表達水平升高可激活ATP耗竭-充盈損傷腎小管細胞和缺血性AKI小鼠模型腎小管中的線粒體自噬，敲除PINK1或PARK2可部分抑制損傷腎小管細胞中的線粒體自噬活性，并加重細胞凋亡；而腎臟IRI誘導的線粒體自噬在PINK1和PARK2單基因或雙基因敲除的腎小管中被部分消除[51]。此外，PINK1和PARK2的單基因或雙基因敲除均會加劇腎小管細胞中受損線粒體的積累、ROS的產生和炎癥，導致更嚴重的腎損傷[52]。

除以上途徑外，線粒體動力學相關蛋白活性也與線粒體自噬水平密切相關。動力相關蛋白1和視神經萎縮蛋白1是調節線粒體動力學的重要因子，均參與調控線粒體的裂變和融合過程[53]。Li等[54]研究顯示，使用抑制劑降低動力相關蛋白1磷酸化水平后可在不影響一般自噬水平的前提下顯著下調由腎臟IRI誘導的線粒體自噬，同時加劇細胞凋亡程度，加重腎功能不全，表明腎臟IRI過程中的線粒體自噬可通過動力相關蛋白1途徑激活，而線粒體自噬可通過清除受損線粒體的方式保護細胞免受IRI所致的細胞凋亡損傷。Feng等[55]的研究則證實，視神經萎縮蛋白1的正常表達在IRI中可激活線粒體自噬、中斷線粒體損傷信號的轉導并降解受損的線粒體，降低視神經萎縮蛋白1表達水平則會加重缺血再灌注導致的腎損傷。

由以上研究可知，線粒體自噬與腎臟IRI密切相關且受多種復雜的分子機制調控，雖然目前多項研究認為適當的線粒體自噬對腎臟IRI可起到保護作用，但仍有部分研究認為線粒體自噬水平升高會損傷腎功能。因此，基于線粒體自噬機制的臨床治療手段仍需進一步研究論證。

2.3腎臟IRI中的線粒體途徑凋亡調控 腎臟IRI中的線粒體途徑凋亡受多種復雜機制的調控，除上述通過調節ROS或線粒體自噬水平調控凋亡外，還存在諸多調控靶點。據Liu等[14]的研究，一種名為JQ1的含溴結合域蛋白4蛋白抑制劑可在腎臟IRI小鼠及HK-2細胞系中通過調控磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路對線粒體途徑凋亡起到抑制作用，同時還可減輕內質網應激程度，降低腎損傷小鼠的血清肌酐、尿素氮水平。多項研究指出，使用外源性藥物調控線粒體凋亡途徑的關鍵啟動因子Bcl-2家族蛋白可調控凋亡水平，如朱敏杰[56]研究指出，大蒜素可以通過調控Bcl-2/Bcl-2相關X蛋白水平抑制腎臟IRI大鼠體內線粒體途徑凋亡。而王穎等[57]的研究表明，缺血預處理可以通過降低Bcl-2家族蛋白表達水平來減輕大鼠IRI中的線粒體途徑凋亡。通過多種手段抑制線粒體膜通透性升高而減少線粒體細胞色素C外流也可降低線粒體途徑凋亡水平。有研究顯示，環孢素A預處理可以減少大鼠缺血再灌注后細胞色素C的外流并減輕線粒體凋亡所導致的腎小管細胞損傷[58]。而在腎臟缺血前對大鼠進行臭氧氧化預處理可通過降低細胞色素C水平減少下游促凋亡因子的釋放，起到抑制線粒體途徑凋亡的作用[59]。他莫克司和褪黑素也可通過減少線粒體中細胞色素C外流減輕缺血再灌注造成的腎損傷[60]。總之，線粒體途徑凋亡在腎臟IRI中扮演重要角色，相信未來將會有更多抗凋亡藥物應用于臨床腎臟IRI的治療。

3 小 結

線粒體在機體內發揮維持各項功能穩態的重要作用，功能正常的線粒體可維持機體供能、參與細胞生長、轉導生理信號。而線粒體功能障礙則會導致ROS、凋亡、自噬等生理/病理狀態的失衡。缺血再灌注造成的線粒體損傷及其相關功能紊亂可導致機體受損。因此，維持正常的線粒體功能對腎臟IRI的治療與預后有重要意義。各種圍繞線粒體ROS產生、線粒體途徑凋亡及線粒體自噬的基礎理論研究為腎臟IRI的線粒體調控治療提供了諸多潛在靶點。雖然目前這些研究的成果大多仍局限于細胞及動物模型，但其中涉及的基礎理論仍為未來腎臟IRI的靶向治療提供了重要的指導性意見。