NIM811對Na2S2O4引起小鼠HT22細胞缺氧/復氧損傷的保護作用的研究

王 丹， 趙承軍， 陳桂生

腦缺血/再灌注損傷是缺血性腦卒中的重要的級聯反應過程，多種機制作用下最終導致神經元等多種腦細胞凋亡、死亡[1]，它對腦組織的損傷比缺血本身造成的損害更嚴重[2,3]。迄今為止，對于腦缺血/再灌注損傷仍無有效的治療手段[4]。甲基-4-異亮氨酸環孢菌素(NIM811)是一種新型非免疫抑制性環孢菌素衍生物，它是環孢素A的同類結構藥物。前期實驗表明NIM811具有降低谷氨酸誘導的神經損傷的治療潛力[5]，但其在腦缺血再灌注中的研究未見報道。氧剝奪/復氧模型是一種常用的模擬體內腦缺血再灌注損傷的經典方法[6]，因此，我們建立體外Na2S2O4引起小鼠H22神經元氧剝奪/復氧模型[7]，探討NIM811是否對Na2S2O4引起小鼠H22神經元缺氧/復氧的神經元具有保護作用，為研究治療缺血性腦卒中和腦缺血再灌注損傷提供實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 HT22小鼠海馬神經元細胞由寧夏顱腦疾病重點實驗室提供，二氧化碳培養箱[HF240，力新儀器(上海)有限公司]；全波長酶標儀(PowerWave XS2，美國Bio-tek公司)；倒置相差顯微鏡(07中地；CKX41，奧林巴斯)；倒置熒光顯微鏡及圖像采集(Ti-S，日本Nikon)；流式細胞儀(AccuriTM C6 Flow Cytometry，美國BD公司)；胎牛血清(BI，舜冉上海生物科技有限公司);CCK-8檢測試劑盒(日本同仁，北京智杰方遠科技有限公司);Na2S2O4粉(純品，無錫市亞泰聯合化工有限司);NIM811(HY-P0025，MCE);Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(KGA107，江蘇凱基生物技術有限公司);活性氧(ROS)檢測試劑盒(S0033，上海碧云天生物技術研究所);線粒體膜電位檢測試劑盒JC-1(C2006，上海碧云天生物技術研究所);Rhod-2 AM鈣離子熒光試劑(ab142780，abcam)。

1.2 NIM811溶液的配置 將5 mg NIM811溶解于4.1576 ml DMSO中，配成1 mmol/L母液。再將1 mmol/L NIM811母液用DMEM培養基稀釋成600 nmol/L的工作液，分裝后冷凍于-20 ℃冰箱中。

1.3 細胞分組 將HT22細胞培養于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM完全培養基中，置于37 ℃，5%CO2培養箱中培養，每2～3 d傳代一次。細胞分組：正常對照組、Na2S2O4組、Na2S2O4+NIM811組、IM811組，正常對照組給予換液處理；Na2S2O4組給予含2 mmol/L Na2S2O4的DMEM培養基進行缺氧1 h，然后更換為DMEM完全培養基繼續培養24 h進行復氧；Na2S2O4+NIM811組提前給予600 nmol/L NIM811預處理2 h，然后換為含有2 mmol/L Na2S2O4和600 nmol/L NIM811的DMEM培養基進行缺氧1 h后，最后給予含有600 nmol/L NIM81的DMEM完全培養基進行復氧24 h；NIM811組在培養24 h后，給予含有600 nmol/L NIM811的DMEM完全培養基繼續培養24 h。

1.4 細胞活性檢測 按前面分組，以 5×103/孔的細胞密度接種96孔板，每組設6個復孔。在細胞培養24 h后，空白對照組給予換液處理，各實驗組按1.3述方法進行處理。在實驗結束前3 h，每孔加入10 μl CCK-8試劑，置于培養箱中培養3 h，用多功能酶標儀檢測OD 值計算細胞存活率。

1.5 細胞凋亡的檢測 按前面分組以1.5×105/ml的細胞密度接種到6孔板，每組設3個復孔，每孔2.5 ml DMEM完全培養液，按照1.3的方法處理細胞后用胰酶消化、離心并收集細胞。進行V-FITC/PI染色，室溫下避光孵育15 min后，置于冰浴，于1 h內在流式細胞儀上檢測。

1.6 線粒體膜電位的檢測 按前面分組以1×105/ml的細胞密度接種到6孔板，每組設3個復孔，每孔2.5 ml DMEM完全培養液，按照1.3的方法處理細胞后用胰酶消化、離心并收集細胞。按照說明書進行JC-1染色，最后加入1 ml JC-1染色緩沖液(1×)重懸細胞，置于冰浴，于1 h內在流式細胞儀上檢測。

1.7 細胞內活性氧(ROS)檢測 按前面分組以2×105/ml細胞密度接種在6孔板中，每組設3個復孔，每孔2.5 ml DMEM完全培養基，混勻，轉移到37 ℃培養箱中，按照1.3處理各組細胞。待實驗結束后，按DCFH-DA說明書進行染色，孵育結束后，置于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 線粒體內鈣離子濃度的檢測(Rhod-2) 以2×105/ml細胞密度接種在6孔板中，每組設3個復孔，每孔2.5ml DMEM完全培養基，混勻，轉移到37 ℃培養箱中，按照1.3處理各組細胞。待實驗結束后，按照說明書進行 Rhod-2 AM染色，孵育結束后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2 結 果

2.1 NIM811對Na2S2O4引起的HT22細胞缺氧/復氧損傷后細胞活性的影響 Na2S2O4組的細胞活性下降約46%(P<0.01)，在給予NIM811處理后，細胞活性有明顯增高38%(P<0.01)(見圖1)。

圖1 NIM811對Na2S2O4引起的HT22細胞損后細胞活性的影響

2.2 NIM811對Na2S2O4引起的HT22細胞缺氧/復氧損傷后細胞凋亡率的影響 右上角為中晚期凋亡的細胞，右下角為早期凋亡的細胞，可以通過計算早期和中晚期細胞凋亡的總數來計算細胞凋亡率。在對照組中，仍存在部分細胞凋亡，與對照組相比2 mmol/LNa2S2O4組的細胞凋亡率明顯增高43%(P<0.01)；給予 NIM811處理細胞后，細胞凋亡率明顯減少27%(P<0.01)(見圖2)。

圖2 NIM811對 Na2S2O4引起的 HT22細胞凋亡率的影響

2.3 NIM811對Na2S2O4引起的HT22細胞缺氧/復氧損傷后線粒體膜電位的影響 JC-1在正常細胞中，產生紅色熒光；在細胞凋亡時，產生綠色熒光。圖中右上角代表紅色熒光所占百分比，右下角代表綠色熒光所占百分比，計算各組紅色熒光/綠色熒光的比值來比較各組膜電位的變化。結果顯示，與對照組相比，Na2S2O4組細胞凋亡明顯增多，而給予NIM811處理后，紅色熒光明顯增多，凋亡減少，與Na2S2O4組比較，差異有統計學意義(見圖3)。

圖3 NIM811對Na2S2O4引起的HT22細胞損傷后線粒體膜電位的影響

2.4 NIM811對Na2S2O4引起的HT22細胞缺氧/復氧損傷后活性氧的影響 利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧檢測。對照組中，有個別細胞熒光增強，說明在正常狀態下有部分細胞活性氧水平較高；Na2S2O4組細胞熒光強度明顯增強，說明細胞給予缺氧/復氧損傷后細胞活性氧水平明顯增高；Na2S2O4+NIM811組中有個別細胞熒光增強，說明細胞經缺氧/復氧損傷并給予NIM811干預后，細胞活性氧水平明顯好轉，而NIM811組細胞熒光不明顯；給予NIM811處理后，Na2S2O4+NIM811組細胞熒光強度較Na2S2O4組降低(P<0.01)，差異有統計學意義，說明NIM811可以降低細胞的活性氧水平(見圖4)。

圖4 NIM811對Na2S2O4引起的HT22細胞損傷后活性氧的影響

2.5 NIM811對Na2S2O4引起的HT22細胞缺氧/復氧損傷后鈣離子濃度的影響 Rhod-2AM染色后觀察各組細胞的鈣離子熒光強度。結果顯示，對照組有部分細胞熒光略強，與對照組比較，Na2S2O4組線粒體鈣離子熒光強度增高，說明經Na2S2O4損傷后，細胞內鈣離子水平增高。在給予NIM811干預后，Na2S2O4+NIM811組細胞鈣離子熒光強度比Na2S2O4組低(P<0.01)，差異有統計學意義，說明NIM811可以降低因Na2S2O4損傷引起的鈣超載水平(見圖5)。

圖5 NIM811對Na2S2O4引起的HT22細胞損傷后鈣離子水平的影響

3 討 論

目前已有研究證實NIM811可以減輕腦缺血后神經損傷[8]。NIM811是否可以改善腦缺血再灌注損傷還沒有明確定論。本研究發現在給予NIM811處理前，Na2S2O4引起的HT22細胞缺氧/復氧損傷后細胞活性下降約46%(P<0.01)；給予NIM811處理后，細胞活性增高38%(P<0.01)，說明NIM811對Na2S2O4引起的HT22細胞缺氧/復氧損傷后細胞活性有保護作用。即NIM811不僅可以減輕腦缺血后神經損傷。并且NIM811沒有環孢素A的免疫抑制作用和毒性作用，其優點是能透過血腦屏障[9]。

研究表明腦缺血再灌注損傷是一系列因素相互影響的結果，主要與鈣離子的負荷、線粒體結構破壞與功能障礙、氧自由基理論、細胞凋亡、炎癥等有關[10～13]。在腦組織缺血期，以細胞壞死為主要表現形式，而在腦缺血再灌注過程中以細胞凋亡為主[14～16]。研究表明，線粒體對細胞凋亡的調控發揮重要的作用[17,18]，主要是由于線粒體膜上的線粒體膜通透轉換孔(MPTP)的開放，釋放炎性介質及氧自由基，誘導細胞凋亡的發生。同時，線粒體缺氧后還會產生過量的活性氧(ROS)，并導致鈣離子內流，使得線粒體膜電位去極化[19]。這些事件的發生最終會進一步誘發細胞凋亡，從而加重腦組織損傷。目前認為，腦缺血再灌注損傷后，細胞內鈣超載可以破壞線粒體的結構與功能[20,21]。本研究觀察到，在Na2S2O4引起的HT22細胞缺氧/復氧損傷后的細胞凋亡率明顯增高43%(P<0.01)，說明在Na2S2O4引起的HT22細胞缺氧/復氧時存在細胞凋亡的現象；給予 NIM811處理細胞后，細胞凋亡率明顯減少27%(P<0.01)，說明NIM811可以改善因Na2S2O4引起的HT22細胞缺氧/復氧損傷后的細胞凋亡，尤其是抑制細胞早期凋亡。同時本實驗觀察在Na2S2O4引起的HT22細胞缺氧/復氧時引起線粒體膜電位變化，活性氧增多，鈣超載現象。給予NIM811處理后，觀察到NIM811減輕了Na2S2O4引起的HT22細胞缺氧/復氧損傷后引起線粒體膜電位超極化，抑制活性氧增多，減少鈣超載。證明NIM811可以提高Na2S2O4引起HT22細胞缺氧/復氧損傷后細胞活性，推測在腦缺血再灌注時，NIM811可能與線粒體通透性轉換孔上的親環蛋白D結合，阻斷線粒體通透性轉換孔MTPT的開放，保護受損的線粒體，抑制細胞凋亡，從而減輕神經元的損傷。即對再灌注后神經損傷也有保護作用。

綜上所述，NIM811對于HT22細胞缺氧/復氧損傷后維護線粒體動力學平衡和抑制細胞凋亡有重要的意義，這對未來研究治療缺血性腦卒中和腦缺血再灌注損傷的藥物時，NIM811作為一種候選藥物提供了實驗室依據。