散葉生菜多酚的提取工藝優化

陳志迪，張思寧，夏 凡，鐘連全，易欣欣，高秀芝*

(1.北京農學院食品科學與工程學院/食品質量與安全北京實驗室/農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206；2.北京市昌平區種子管理站，北京 102200)

植物多酚是一種小分子天然有機化合物，由植物生長發育代謝活動而產生，廣泛存在于植物的表皮、根系、葉和果實中[1]。植物多酚屬于芳香族羥基化合物，根據結構不同分為兩大類：一類是類黃酮，包括黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、查爾酮類等；另一類是非類黃酮，包括芪類、單寧、酚酸類等[2]。多酚具有抑菌[3]、預防糖尿病和心血管疾病[4-5]、促進抗癌細胞增殖[6]等生物活性。以植物多酚為原料的天然防腐劑因其性能高效、安全性好，且具有一定營養價值，廣泛用于食品工業領域[7]。

生菜(LactucasativaL.)又名葉用萵苣、鵝子菜、麥子菜、萵籽菜，為一年生或二年生草本植物[8]。食用方法多樣，因其口感清脆、營養物質含量豐富，作為生食蔬菜廣受大眾歡迎[9]。生菜起源于歐洲，從東南沿海地區引進至中國[10]。PEPE等[11]研究表明，萵苣中含有羥基肉桂酸、鄰氧萘酮、黃烷醇等16種多酚類化合物，具有良好的抗氧化和抗炎活性。MARTíNEZ-SáNCHEZ等[12]研究發現綠葉萵苣主要含酚酸類物質，紫葉萵苣中含豐富的黃酮醇。

多酚的提取方法主要有溶劑浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法等[13]。超聲輔助提取法操作過程簡單，成本低廉，是目前應用最為廣泛的一種多酚提取方法。王佰靈等[14]利用Box-Behnken響應面法對景天三七總多酚的超聲輔助提取工藝進行優化，優化因素包括液料比、乙醇體積分數、超聲時間、超聲溫度。

該試驗擬采用超聲輔助提取法，利用單因素結合正交試驗的方法研究乙醇體積分數、料液比、超聲時間、超聲溫度4個因素對散葉生菜中的多酚提取量的影響，優化散葉生菜多酚的提取工藝，確定散葉生菜多酚提取的最佳工藝條件，比較5種散葉生菜多酚的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料散葉生菜，其中提取條件優化所用散葉生菜購自北京農學院超市；北散生1號、北散生2號、北紫生1號、北紫生2號、北紫生3號來自昌平農作物試驗展示基地；沒食子酸標準品(純度≥98%)：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇，分析純：北京東方博遠科技發展有限公司。

真空冷凍干燥機(CHRIST凍干機有限公司)，旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 方 法

1.2.1 提取工藝 新鮮散葉生菜葉片30 g，真空冷凍干燥24 h，粉碎后過250 μm篩，超聲輔助乙醇浸提，8 000 r/min離心15 min，得到多酚粗提液。

1.2.2 多酚含量的測定 散葉生菜中多酚含量的測定采用福林酚法[15]，按公式1計算多酚含量mg/kg(以沒食子酸計)，X為散葉生菜中多酚含量，mg/kg；C為標準曲線多酚質量濃度，mg/mL；V1為稀釋體積，mL；V2為乙醇溶液體積，mL；V3為量取的多酚粗提液體積，mL；M為散葉生菜鮮重，g。

X=(C×V1×V2)/(M×V3)×1 000

(公式1)

1.2.3 標準曲線繪制 根據康超等[16]的研究方法略作修改，在OD765 nm下測量吸光度。縱坐標為吸光度，橫坐標為沒食子酸質量濃度，繪制標準曲線。

1.3 散葉生菜中多酚提取工藝

1.3.1 單因素試驗 在料液比1∶30，超聲溫度50 ℃，超聲時間60 min，乙醇體積分數分別為50%、60%、70%、75%和80%的條件下提取散葉生菜多酚，在OD765 nm下測定吸光度并計算多酚含量。

在乙醇體積分數70%，超聲溫度50 ℃，超聲時間60 min，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，提取散葉生菜多酚，在OD765 nm下測定吸光度并計算多酚含量。

在乙醇體積分數70%，料液比1∶30，超聲溫度50 ℃，超聲時間分別為30、45、60、90和120 min的條件下提取散葉生菜多酚，在OD765 nm下測定吸光度并計算多酚含量。

在乙醇體積分數70%，料液比1∶30，超聲時間60 min，超聲溫度分別為30、40、45、50和60 ℃的條件下提取散葉生菜多酚，在OD765 nm下測定吸光度并計算多酚含量。

1.3.2 正交試驗設計 選擇乙醇體積分數、料液比、超聲時間和超聲溫度作為4個因素，每個因素分別選取3個水平，進行L9(34)四因素三水平正交試驗，以確定散葉生菜中多酚的最優提取條件。以正交表中最佳組合為優化組、正交試驗各因素最佳水平組為對照組，對最優條件組合進行驗證。

表1 試驗因素水平表Tab.1 Level of experimental factors

1.4 數據統計分析

每個試驗都有3組平行，并將得到的數據取平均值。使用Excel軟件進行單因素試驗和正交試驗的數據分析并繪圖，數據統計分析選用Excel-2016和SPSS19.0，差異顯著性為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

根據沒食子酸的質量濃度與吸光度，得到標準曲線如圖1。標準曲線的回歸方程Y= 25.831X-0.0005，其中Y為吸光度，X為沒食子酸質量濃度(mg/mL)，線性回歸系數R2= 0.9992。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數對散葉生菜多酚提取量的影響 當乙醇體積分數70%時散葉生菜多酚的提取量達到最大值，為522.16 mg/kg(圖2)。出現這種情況可能由于多酚的結構中帶有羥基具有一定極性，乙醇與多酚的極性越接近，各物質之間的化學鍵越容易被破壞，則多酚提取量越高[17]。乙醇體積分數選取60%～75%這個區間繼續后續正交試驗。

圖2 乙醇體積分數對散葉生菜多酚提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction of polyphenols from leaf lettuce

2.2.2 料液比對散葉生菜多酚提取量的影響 料液比對散葉生菜多酚提取量的影響如圖3所示。在料液比1∶15時散葉生菜中多酚提取量達到最大值，之后隨料液比的增大，散葉生菜多酚提取量下降。可能是由于在1∶15時多酚的溶解達到飽和，繼續增大料液比增大其他雜質的溶出率，從而導致多酚提取量降低[18]。選取1∶10～1∶20這個區間的料液比進行后續正交試驗。

圖3 料液比對散葉生菜多酚提取量的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction amount of polyphenols from leaf lettuce

2.2.3 超聲時間對散葉生菜多酚提取量的影響 當超聲時間60 min時，散葉生菜中的多酚提取量達到最大值。隨著超聲時間的增大散葉生菜多酚提取量反而減少(圖4)。如果超聲時間太短，則多酚將無法充分溶解，提取率會偏低，如果超聲時間太長，會使提取溫度升高導致多酚受熱氧化分解，而且隨著提取溫度升高，細胞通透性增大，其他物質的溶出也會影響提取率[19]。超聲時間選取45～90 min這個區間進行正交試驗。

圖4 超聲時間對散葉生菜多酚提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction of polyphenols from leaf lettuce

2.2.4 超聲溫度對散葉生菜多酚提取量的影響 隨著超聲溫度的增加，散葉生菜多酚提取量先略有下降后上升至頂峰最后又下降(圖5)。在50 ℃時多酚提取量最高。超聲溫度的升高促進多酚的溶解，但如果超聲溫度過高，則散葉生菜的多酚會熱分解，破壞已提取出多酚的結構，使多酚得率降低[20]。后續正交試驗選擇45～60 ℃這個范圍內的超聲溫度。

圖5 超聲溫度對散葉生菜多酚提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the extraction of polyphenols from leaf lettuce

2.3 正交試驗

表2為正交試驗結果。根據R值大小可以看出各因素對散葉生菜多酚提取量的影響大小順序為：乙醇體積分數>超聲溫度>超聲時間>料液比；正交試驗得出最優工藝組合為乙醇體積分數75%、料液比1∶20、超聲時間60 min、超聲溫度60 ℃。

方差分析見表3。乙醇體積分數F值6.461，料液比F值0.194，超聲時間F值1.519，超聲溫度F值3.940。從而可知，乙醇體積分數對散葉生菜多酚提取效果具有極顯著性影響(P<0.01)，超聲溫度對散葉生菜多酚提取效果具有顯著影響(P<0.05)，而料液比和超聲時間對散葉生菜多酚提取效果的影響不顯著(P>0.05)。

表2 散葉生菜多酚提取正交試驗結果表(L934)Tab.2 Orthogonal test results (L934) of leaf lettuce polyphenols

乙醇體積分數對散葉生菜多酚提取效果具有極顯著性影響(P<0.01)，可選擇75%；超聲溫度對散葉生菜多酚提取效果具有顯著影響(P<0.05)，可選擇60 ℃；而料液比和超聲時間均對散葉生菜多酚提取效果的影響不顯著(P>0.05)，且根據k值的大小發現料液比1∶10與1∶20的均值相差不大，故從成本方面考慮，可選最佳料液比為1∶10，而超聲時間60 min值最大，故超聲時間60 min為最佳可取值。

超聲提取工藝的最優條件為乙醇體積分數75%、料液比1∶10、超聲時間60 min、超聲溫度60 ℃，這是理論上超聲提取散葉生菜多酚的最佳工藝條件。

表3 正交試驗結果方差分析表Tab.3 Orthogonal experiment results analysis of variance table

2.4 驗證試驗

驗證試驗結果見表4。多酚提取量分別為(1 233.5±49.7)mg/kg、(1 152.6±25.5)mg/kg和(1 128±12.53)mg/kg，超聲提取散葉生菜多酚的最佳工藝條件為乙醇體積分數75%、料液比1∶10、超聲時間60 min、超聲溫度60 ℃。

表4 散葉生菜多酚提取工藝驗證試驗結果表Tab.4 Validation test result table of polyphenol extraction technology from leaf lettuce

2.5 不同品種散葉生菜多酚含量

選用最佳提取工藝對5種散葉生菜的多酚進行提取，測定含量見圖6。不同品種散葉生菜之間多酚含量存在差異，其中北紫生1號多酚含量顯著高于其他品種(P<0.05)，含量為(1 176±48.5) mg/kg；北散生2號的含量最低為(622.3±65.2) mg/kg。

注：ab表示差異顯著(P<0.05)。Note:ab means significant difference (P<0.05).圖6 不同品種散葉生菜多酚含量Fig.6 Contents of polyphenols in different varieties of leaf lettuce

3 討 論

該試驗通過單因素結合正交試驗的方法優化散葉生菜多酚超聲輔助提取的最佳工藝，多酚可以溶于水和醇類、醚類、酮類等有機溶劑[21]，常用的有機溶劑包括乙醇、甲醇、丙酮等，乙醇毒性小、回收率高，所以該試驗選用乙醇作為提取溶劑。楊文娟等[22]對花生多酚的超聲輔助提取工藝進行優化，各因素對提取量的影響大小順序為乙醇體積分數、超聲溫度、料液比、超聲時間。在該試驗中，4種因素對散葉生菜多酚提取量的影響程度與楊文娟等[22]研究結果大致相同，乙醇體積分數影響是最大的，其次是超聲溫度，雖然超聲時間和料液比的結果不一致，但是這兩種因素影響較小。用最優提取工藝提取5種不同的散葉生菜多酚，不同品種散葉生菜多酚含量存在差異，楊曉等[23]在研究中發現不同品種生菜酚類物質含量存在差異，即使相同品種，由于光照和采收時間不同，總酚含量也有差異。

該試驗通過單因素和正交試驗探究乙醇體積分數、料液比、超聲時間、超聲溫度對散葉生菜中多酚提取量的影響，各因素的影響順序為乙醇體積分數>超聲溫度>超聲時間>料液比；最佳提取工藝為乙醇體積分數75%、料液比1∶10、超聲時間60 min、超聲溫度60 ℃；北紫生1號的多酚含量顯著高于其他品種，為(1 176±48.5)mg/kg。