豬圓環病毒3型衣殼蛋白抗體間接酶聯免疫吸附測定方法的建立與應用

謝曉妍，石玉佩，李瀟南，段燕方，張永紅，周雙海

(北京農學院動物科學技術學院，北京 102206)

豬圓環病毒屬于圓環病毒科圓環病毒屬，具有多種基因型。豬圓環病毒1型(porcine circovirus type 1，PCV1)是20世紀70年代被發現的，對豬沒有致病性[1]。豬圓環病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)是20世紀90年代被發現的，能引起多種豬圓環病毒疾病，給世界養豬業造成較大經濟損失[2]。豬圓環病毒3型(porcine circovirus type 3，PCV3)是在2016年被報道發現的，能引起豬皮炎與腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)，并與母豬繁殖障礙和心肌炎等疾病相關[3-5]。由于PCV2的廣泛性分布和對養豬業的顯著危害性，PCV3被發現后就迅速引起養豬行業人員的關注。目前PCV3已在中國的多個地區被檢出，并顯示出較高的感染率[6-8]。目前沒有PCV3商品疫苗，加強PCV3感染的診斷和流行病學調查具有重要臨床意義。

目前，對PCV3感染的檢測主要依賴于PCR技術，尚缺乏商品化的PCV3抗體檢測試劑盒。與PCV2相同，PCV3也只有一個結構蛋白，也就是衣殼蛋白[3,9]。對于PCV2，衣殼蛋白是診斷抗原的最重要靶蛋白[2]。對于PCV3，已在其衣殼蛋白上發現3個保守的B細胞抗原表位[10]，故其可作為診斷抗原。該研究旨在利用前期原核表達的截短型重組PCV3衣殼蛋白[11]建立一種檢測PCV3衣殼蛋白抗體的間接酶聯免疫吸附測定方法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，以期建立一種檢測PCV3抗體和PCV3感染的血清學方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和血清

純化的截短型重組PCV3衣殼蛋白抗原由北京農學院動物疫病研究室制備[11]；兔抗豬IgG-HRP、四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)顯色液、終止液、洗滌液等均為北京索萊寶科技有限公司產品。PCV1、PCV2、PCV3、偽狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)、豬細小病毒(porcine parvovirus，PPV)、豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)及豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的陽性血清和PCV3陰性血清由北京農學院動物疫病研究室保存。

1.2 間接ELISA的基礎操作步驟

取重組PCV3衣殼蛋白抗原包被的酶標板條，在室溫下加入血清，37 ℃孵育60 min；棄去液體，用洗滌液洗滌3次，每次1 min，在濾紙上拍干；加入兔抗豬IgG-HRP，37 ℃孵育60 min；用洗滌液洗滌3次，每次1 min，在濾紙上拍干；加入TMB顯色液，37 ℃避光反應15 min；加入終止液，15 min內用酶標儀測定OD450 nm值。

1.3 間接ELISA反應條件的篩選

將包被抗原的不同梯度稀釋質量濃度(4.880、2.440、1.220、0.610、0.305 μg/mL)和血清的不同梯度稀釋度(1∶25、1∶50和1∶100)組成方陣，按照“1.2”間接ELISA的基礎操作步驟進行方陣滴定試驗篩選和確定最佳的包被抗原質量濃度與血清稀釋度。依次對血清孵育時間(0.5、1.0、1.5和2.0 h)、酶標二抗的稀釋度(1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000和1∶16 000)和孵育時間(0.5、1.0、1.5和2.0 h)、TMB底物反應時間(5、10、15、20和25 min)按照“1.2”間接ELISA的基礎操作步驟進行篩選和優化。

1.4 陰陽性臨界值的確定

取30份PCV3陰性血清，按已確定的間接ELISA最佳反應條件進行檢測，計算其OD450 nm值的平均數(x)和標準差(SD)。當OD450 nm值≥x+3SD時，判為陽性；當OD450 nm值

1.5 特異性試驗

用“1.3”已確定的最佳反應條件檢測PCV1、PCV2、PRV、PPV、CSFV、PRRSV和PEDV陽性血清，同時用PCV3的陽性血清和陰性血清作為對照，檢測所建立方法的特異性。

1.6 重復性試驗

用同一時間制備的酶標板檢測6份血清，每份血清重復檢測3次，計算變異系數，評估批內試驗的可重復性。用3個不同時間制備的酶標板檢測這6份血清，每份血清重復檢測3次，計算變異系數，評估批間試驗的可重復性。

1.7 臨床樣品檢測及統計分析

用建立的間接ELISA檢測方法對2019年來自河北地區的70份、北京地區的248份豬血清樣本進行檢測，并用卡方檢驗對兩個地區的抗體陽性率進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 間接ELISA反應條件的確定

包被抗原質量濃度和血清稀釋倍數的方陣滴定結果見表1。當包被抗原質量濃度為0.610 μg/mL、血清稀釋度為1∶25時，P/N值最大、為12.495，故確定間接ELISA的最佳包被抗原質量濃度為0.610 μg/mL、最佳血清稀釋度為1∶25。依次確定最佳血清孵育時間為1.0 h，酶標二抗的最佳稀釋度為1∶4 000、最佳孵育時間為1.0 h，TMB底物最佳反應時間為15 min。

表1 包被抗原質量濃度和血清稀釋度的篩選Tab.1 Screening of the coating antigen concentration and serum dilution ratio

2.2 陰陽臨界值的確定

按照確定的最佳反應條件，檢測30份PCV3陰性血清，計算得出平均數ˉx= 0.122，標準差SD=0.029。故確定，當待測血清樣品OD450 nm值≥0.209時，判為陽性；當OD450 nm值<0.180時，判為陰性；而當0.180≤OD450 nm值<0.209時，判為可疑。

2.3 特異性試驗結果

用建立的檢測方法檢測PCV1、PCV2、PRV、PPV、CSFV、PRRSV和PEDV陽性血清，并設立PCV3陽性血清和陰性血清對照，結果(表2)顯示只有PCV3陽性血清的檢測結果為陽性，說明建立的檢測方法具有良好的特異性。

表2 特異性試驗數據Tab.2 Data of specificity test

2.4 重復性試驗結果

批內重復性試驗結果見表3，變異系數介于0.78%～3.57%之間，都小于5%，表明批內重復性良好。批間重復性試驗結果見表3，變異系數介于0.60%～4.32%之間，都小于5%，表明批間重復性良好。

表3 重復性試驗數據Tab.3 Data of repeatability test

2.5 臨床樣品檢測結果

用建立的間接ELISA檢測方法檢測2019年從河北地區、北京地區采集的血清樣品，檢測出總的PCV3抗體陽性率為32.70%。其中，河北地區的檢測陽性率為42.86%(30/70)，北京地區的檢測陽性率為29.84%(74/248)，二者之間無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

PCV3是2016年首次發現的一種新的致病性豬圓環病毒[3]，已經在中國一些地區和豬場流行，并呈逐漸上升趨勢[12]。目前，中國對于PCV3感染的檢測，大多數采用PCR方法檢測病毒核酸；但是在大規模檢測時，用ELISA等血清學方法檢測病毒抗體無疑要更加實用，不過目前中國還沒有檢測PCV3抗體的商品化試劑盒。

由于衣殼蛋白是豬圓環病毒的唯一結構蛋白，并具有良好的免疫原性，因此，檢測豬圓環病毒感染的抗體檢測試劑絕大多數都是基于其衣殼蛋白作為診斷抗原而研制的。有研究者比較分別以全病毒和衣殼蛋白為診斷抗原而建立的檢測PCV2抗體的兩種ELISA，發現用衣殼蛋白作為診斷抗原時更加有效[13]。前期試驗已經高效表達出包含有PCV3衣殼蛋白大多數抗原表位的截短的重組衣殼蛋白[10-11]，以之作為抗體檢測用的包被抗原，按照間接ELISA操作規程對其各項反應條件進行篩選與優化，建立一種可用于檢測PCV3抗體的間接ELISA。這一方法能夠有效檢測臨床血清樣品中的PCV3抗體，并且不會與當前普遍存在的其他豬傳染病病原的陽性血清發生交叉免疫反應，顯示出良好的特異性。這一方法的批內重復性試驗和批間重復性試驗的變異系數都小于5%，顯示出良好的可重復性。用該方法檢測來自2019年北京地區與河北地區的318份血清樣本，發現這兩個地區PCV3抗體的總體陽性率為32.70%，與之前的PCR檢測結果相近[7-8]，表明北京地區與河北地區的豬場存在較多的PCV3感染。PCV3作為一種新近出現的致病性豬圓環病毒，不僅能夠試驗感染引起PDNS[5]，還被認為與母豬繁殖障礙有關[3]，故存在PDNS和母豬繁殖障礙的地區與豬場，需要注意防范PCV3的傳入和感染。

試驗建立的PCV3衣殼蛋白抗體間接ELISA具有良好的特異性和可重復性，能夠對臨床樣品進行有效檢測，為PCV3感染的診斷及其流行病學調查提供一種技術支撐，也為PCV3 抗體檢測間接ELISA試劑盒的商品化建立基礎。