81個矮牽牛自交系遺傳多樣性的分析

張西西，李 芳,許 超，徐 菁，華 瑩，張春和

(北京市園林綠化科學研究院/綠化植物育種北京市重點實驗室，北京 100102)

矮牽牛[Petuniahybrida(J. D. Hooker) Vilmorin]別名碧冬茄、矮喇叭，番薯花，毽子花等，茄科碧冬茄屬多年生草本植物，原產(chǎn)于南美洲阿根廷，現(xiàn)在世界各地廣泛栽培。在溫度適宜的情況下，矮牽牛一年四季均可開花，是節(jié)日花壇用花的常用材料[1-2]。對種質(zhì)資源進行深入研究，是培育矮牽牛新品種的前提與基礎。傳統(tǒng)的植物形態(tài)標記等研究手段較少，此外，由于表型容易受到環(huán)境影響，性狀表達容易不穩(wěn)定[3]。目前在全世界范圍內(nèi)普遍采用分子標記技術研究植物遺傳多樣性和親緣關系，相關的研究報道不少。迄今利用分子標記技術研究植物矮牽牛遺傳多樣性和親緣關系的研究報道很多，但以矮牽牛為對象的相關研究報道還比較少。葉為[4]利用相關序列擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)和簡單重復序列間區(qū)標記(inter simple sequence repeat，ISSR)對18個矮牽牛自交系進行了親緣關系的研究；吳志祥等[5]利用ISSR對142個矮牽牛品種進行遺傳多樣性分析；徐進等[6]利用SRAP對58個矮牽牛品種進行了遺傳關系分析。利用擴增片段長度多態(tài)性標記(amplified fragment length polymorphism，AFLP)分析矮牽牛自交系的遺傳關系尚未見報道。

AFLP分子標記技術是常用的一種分子標記方法，具有多態(tài)性強、穩(wěn)定性高、重復性好等特點[7-8]，是一種理想、有效的遺傳標記方法，廣泛用于植物親緣關系等相關研究[9-12]，同時，也在經(jīng)濟作物中被廣泛應用[13-15]同時應用在蔬菜遺傳關系的研究中[16-17]。在園林觀賞植物研究中，AFLP廣泛用于海棠等木本觀賞植物[18-22]。由于AFLP技術相對SRAP等分子標記來講，試驗步驟較為復雜，近年來，采用SRAP等分子標記研究觀賞花卉的遺傳多態(tài)性較為常見[23-25]，而用AFLP研究花卉的報道數(shù)量較少[26-28]，利用AFLP研究矮牽牛自交系遺傳多態(tài)性還未見報道。

該研究以北京市園林綠化科學研究院收集的81個矮牽牛自交系為材料，采用AFLP對其進行遺傳多樣性的分析，旨在明確自交系之間的親緣關系，為新品種選育和品種保護提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2013年在北京市園林科學研究院內(nèi)進行81個矮牽牛自交系(表1)的種植。

表1 81個矮牽牛自交系性狀表Tab.1 Name and origin of Petunia hybrid germplasm used in the experiment

1.2 試驗方法

AFLP試劑盒購自北京鼎國生物科技有限公司，試驗方法參考VOS等[3]的方法。每個樣品總DNA 200 ng，經(jīng)限制內(nèi)切酶(2 μL ECORI和2 μL MSel)消化后，在消化片段末段加入人工接頭。

共使用8對選擇性引物。其堿基組合為：H-AAG/M-CTC、H-ACA/M-CTC、H-AAG/M-CTT、H-ACT/M-CTT、H-AGC/M-CTC、H-AGC/M-CTT、H-ACC/M-CTC、H-AGG/M-CTT。

采用十六烷基三甲基溴化銨法提取矮牽牛幼葉基因組DNA，利用序列相關擴增多態(tài)性分子標記對基因組DNA進行多樣性和相似性分析。在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上分離擴增片段。凝膠用硝酸銀染色，根據(jù)電泳結果得到“0”或“1”基質(zhì)。多態(tài)位點數(shù)、多態(tài)位點百分比、有效等位基因數(shù)和遺傳多樣性指數(shù)由POPGENE版本32估算。利用NTSYS pc-V.2.1估計的遺傳相似性對81個矮牽牛自交系按非加權組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA) 進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結果與分析

2.1 擴增結果

采用3個選擇性堿基的引物組合，獲得較好的擴增效果，電泳條帶數(shù)目豐富，分帶清晰(表2和圖1)。8對引物組合擴增出216個遺傳位點，81個矮牽牛自交系共獲得24 351條擴增帶，全部為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率100%。81個矮牽牛自交系擴增帶分布較均勻，擴增帶最少的是258條，最多的是478條，平均每對引物擴增出3 044個多態(tài)性位點。

表2 8對引物擴增的多態(tài)性條數(shù)Tab.2 The number of polymorphic bands generated by 8 primer pairs

2.2 聚類分析

通過杰卡德相似系數(shù)，計算出遺傳相似性系數(shù)在0.2443～0.6233之間，平均值0.4338，每個位點的有效等位基因數(shù)1.2236,平均多樣性指數(shù)0.2422；遺傳相似性系數(shù)最高的是4號和5號，達到0.6233，最低的是9號和92號，為0.2443。按非加權組平均法進行聚類，構建聚類圖(圖2)。在聚類圖中，取遺傳相似性系數(shù)水平0.36時，將聚類圖中81個矮牽牛自交系分為3個類群。

2.3 利用AFLP對81個矮牽牛自交系的聚類結果

81個供試的矮牽牛材料中，全部為自交系。花色有紅、粉、白、玫紅、淺粉、藍、紫紅、紫等類型。相似系數(shù)0.36時，可將81個矮牽牛自交系分為3個類群：91和92號2個自交系，花色分別為粉和粉紅的小花型自交系，單獨聚為第Ⅰ類；58號、73號和78號，花色分別為白、淺粉和粉，為中花型自交系，聚為第II類。由于在傳統(tǒng)的雜交育種中，一般會根據(jù)花徑來進行自交系選育，長期以來，形成大花型自交系和小花型自交系。花徑相近的自交系親緣關系較近，這與葉為[4]的研究結果是一致。

其余76個大花型自交系聚為第Ⅲ類。由于這一類群的自交系數(shù)量比較大，根據(jù)色系的不同，將其分為8個小類群。100號花色為藍，單獨聚為A類群，115號為藍，單獨聚為B類群；22號花色為白，單獨聚為C類群；60號、65號、66號、72號、80號、64號、77號、69號、81號、79號和71號共計11個自交系，均由北京市園林綠化科學研究院課題組從美國泛美種子公司的矮牽牛品種‘波浪’系列的玫紅品種實生變異單株選育而來，為大花粉和淺粉系，聚為D類群；108和120號花色是紫，聚為E類群。102號輕脈紋粉和105號淺粉聚為F類群。14號、17號、35號、18號、90號、83號、84號、49號和53號共計9個自交系，分別為粉紅、玫紅、粉、輕脈紋粉等，聚為G類群；其余的歸為H類群。

第Ⅲ類群中的H類型還可進一步細分為3個更小的類群。第①小類為編號1號、9號、3號和6號，花色為紫和白；第②小類編號為2號、85號、47號、4號、5號、12號、40號、30號、13號、20號、27號、15號、24號、36號、25號、38號、29號、34號、16號、48號、52號、50號、82號、56號、7號、111號、87號、116號、119號、96號、18號、97號、61號、62號、44號、57號、26號、95號、8號、10號、51號、86和94號，共計43個自交系；第③小類為編號112號和117號自交系，花冠紫色聚為一類。在第②小類中，主要集中白、淺粉、玫紅、紅、紫紅、鮭紅幾個色系。這與徐進等[6]用SRAP進行矮牽牛F1代遺傳關系的聚類結果基本一致，但略有不同。

3 討 論

該研究通過篩選的8對AFLP引物組合對81個矮牽牛自交系進行多樣性分析，共擴增出24 351條譜帶，全部為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率為100%。AFLP靈敏度高，能對親緣關系較近的種質(zhì)資源材料的親緣關系進行遺傳關系分析。AFLP聚類分析與形態(tài)學聚類總體結果一致。除11個變異株培育成的自交系外，81個矮牽牛自交系可分為3個大的類群。這一結果與花型為基礎的聚類分析一致[4]。

81個矮牽牛自交系中，大花型的自交系占絕大多數(shù)。由于這個類群的自交系數(shù)量多，根據(jù)不同花色，將其分成藍色、白色、粉色、紫色、淺粉色-輕脈紋以及粉紅-玫紅等不同亞類群。分子聚類結果為北京市園林綠化科學研究院的自育品種知識產(chǎn)權的保護提供重要依據(jù)。Ⅲ類群的D亞類群是北京市園林綠化科學研究院課題組根據(jù)自然突變單株選育的粉色系自交系，與其他自交系的遺傳關系較遠，可作為新品種選育的重點材料。

Ⅲ類群還有一部分自交系組成比較復雜，將其歸為H亞類群，并進一步細分為3個更小的類群。第①小類為白色系+紫色系，由4個自交系組成；第②小類白色系+玫紅等暖色系，由43個自交系組成；第③小類是2個紫色自交系。粉紅色系和紫色、藍色系自交系聚為不同的類群，同時白色系與冷暖色調(diào)的自交系分別聚在一起。在徐進等[6]的報道中，白色品種只和紫色等冷色調(diào)品種聚在一起。該試驗結果是白色與粉色、紅色系聚在一起，同時另一些白色自交系與紫色系聚在一起。而在傳統(tǒng)的矮牽牛雜交試驗中，粉色單株的分離后代會出現(xiàn)一些白色自交系，某些紫色單株在高溫下會出現(xiàn)白色的花朵。傳統(tǒng)雜交試驗表明一些白色自交系與紫色自交系和粉色自交系的遺傳關系都很近。該研究得出的分子聚類結果與雜交試驗結果相吻合。分析原因可能是由于徐進等[6]試驗材料采用的是F1代品種，白色品種可能分別由遺傳背景較遠的2個白色自交系雜交而成，與其他顏色的雜交一代遺傳關系較遠。而該研究所用材料全部來源于自交系，在自交過程中，白色自交系由其他顏色自交系分離而來，因而遺傳關系較近。

在UPGMA聚類圖上，81個矮牽牛自交系可根據(jù)花徑和花色進行分類。這與吳志祥等[5]研究結果略有不同。分析可能是由于該研究采用的81個矮牽牛自交系最早由表型性狀優(yōu)良的單株自交多代而來，花型相同、顏色相近的自交系親緣關系較近。而吳志祥等[5]采用的是來源于世界各地的雜交一代品種，由不同遺傳背景的自交系雜交而來的可能性較大。由于遺傳背景復雜，無法單一根據(jù)花型和花色進行完全聚類。對于矮牽牛育種來講，世界各地的育種公司之間的遺傳材料的交流比較頻繁，同一系類不同顏色材料之間親緣關系較遠。同一品種的親本可能來自遺傳背景相差較大的自交系，這有利于矮牽牛雜交育種培育新品種。

根據(jù)UPGMA分子聚類圖，D亞類群自交系全部由自然突變而來，與其他自交系遺傳背景不同，在將來的育種工作中可作為重點育種材料。親緣關系越遠的自交系雜交，所得到的雜交一代的雜種優(yōu)勢有可能越強。在相應花徑、花色范圍內(nèi)，盡量選擇親緣關系較遠的自交系雜交，其后代的雜種優(yōu)勢出現(xiàn)的可能性越大。