3種不同規?；囵B模式對湛江等鞭金藻生產力及色素含量的影響

呂 布,楊守國,VASQUEZ Hebert Ely,王愛民,鄭 興,顧志峰

(1 海南大學海洋學院，海南 ?？?570228; 2 海南大學南海海洋資源利用國家重點實驗室,海南 海口 570228;3 海南省海洋與漁業科學院，海南 ?？?571126)

湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)是一種重要的水產經濟微藻，具有個體小、繁殖快、營養豐富、運動速度適中、不含纖維素細胞壁等特點，易被水生動物幼蟲捕捉吞食和消化吸收，常作為海產經濟雙殼類等動物幼蟲的基礎餌料[1-3]。

微藻一般分為室內和室外兩種養殖方式。室內環境下，主要通過5 L或更小的錐形瓶為培養容器進行培養，主要特點為精細化培養，但培養規模較小，一般作為一級藻種培養的開展模式。室外環境下，主要以容積300 L以上的容器進行培養，如玻璃鋼桶、水泥池，主要特點是培養規模大，但精細化程度較低、易污染[4-5]。水產生產活動中所使用的微藻餌料基本是通過室外開放式規?；a所得，該生產方式一般為一次性生產，易發生污染、倒藻現象，繼而影響效益[6]。

室外光生物連續培養器近年來受到微藻生產企業的推崇，其主要特點是可進行連續性高密度培養，不易污染，可規?；a[7-8]。室外光生物連續培養器具有可高效生產、所獲微藻生物質量較高、土地使用面積效率相對較高等特點，使其成為可代替水泥池等占地面積大的微藻傳統養殖模式的有效手段之一[9-11]。室外光生物連續培養器作為新型培養模式，相對聚乙烯桶、水泥池等傳統模式的相關工作要求較高，如對操作者也具有一定管理技術要求，傳統養殖戶因對其不了解而不敢輕易接受并進行生產嘗試[12]。關于室外光生物連續培養器與目前生產上常用的聚乙烯桶、水泥池等模式之間的生產效率和質量的比較研究報道則更為少見，因此使得新技術在養殖戶中的推廣工作變得緩慢。

本研究以湛江等鞭金藻為研究對象，比較探究了管道式光生物反應器養殖模式與傳統微藻室外規?；B殖模式(聚乙烯桶和水泥池)生產力及生產效果之間的詳細差異，以期為微藻生產新模式的推廣及技術優化奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

所用湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)來源海南大學海洋學院微藻保種室。試驗前將藻種進行純化擴培，取快速生長期的藻液開展室外培養試驗。所用培養液為本課題組基于“寧波3#微藻培養液” 而進一步優化所得，具體配方為：化肥尿素 50 mg、NaH2PO410 mg、 FeSO42.5 mg、MnSO40.25 mg、EDTA-2Na 10 mg、VB16× 10-3mg、VB120.5×10-6mg、過濾海水1 L。

試驗所用水體為經過沙井過濾、沉淀、漂白水消毒后的自然海水。室外培養過程中的溫度、光照強度、濕度、光周期等理化條件為自然條件。

1.2 試驗設計

試驗在 3 種不同的養殖模式中進行(圖1)。聚乙烯桶的工作體積約 1 000 L；傳統水泥池工作體積約 3 000 L；管道式光生物反應器工作體積約 2 000 L，其中管道式光生物反應器的供氣系統由泵、輸氣管、調節閥組成。試驗充氣量基本統一控制為 20 L/min；接種細胞密度約為10.0×104cells/mL。光照為正常自然條件。

圖1 試驗所用微藻室外規?；囵B模式

試驗組別接入藻種混勻后，每隔24 h進行取樣，進行藻類細胞數目、干重、色素含量、總蛋白含量及可溶性糖含量指標的檢測。

1.3 檢測指標及方法

(1)藻細胞數目的測定。采用血球計數板法進行測定[13]。

(2)藻細胞干重的測定。預先稱重烘干Whatman GF/C過濾膜，將一定體積的藻液在該膜上過濾，經過沖洗除營養鹽后，放到105 ℃烘箱中烘干72 h以上后稱重，直至前后兩次質量差不超過2 mg，然后計算兩者的差值代表干重[14]。

(3)藻細胞內生物質的測定。

①葉綠素含量：利用丙酮萃取法提取微藻體內葉綠素，取待測藻液樣品 20 mL，通過抽濾于Whatman GF/C膜上，隨后用鑷子將Whatman GF/C膜取下置于50 mL離心管底部，加入10 mL的90 %丙酮溶液，立即放入4 ℃冰箱中避光保存24 h以上(1～3 d均可)，黑暗低溫條件下進行萃取。萃取后在4 ℃，4 000 r/min條件下離心10 min，將離心后的提取液上清液小心注入1 cm比色皿，以90 %丙酮溶液作參比，分光光度計(島津UV-1700)分別測定在波長630、647、664 nm處溶液的吸光度值并記錄,減去波長750 nm下測得的吸光度值，得到校正后的E664、E647、E630值。按照以下的方程式計算葉綠素a(Cchla)、葉綠素b(Cchlb)和總葉綠素(Ctch1)的質量濃度[15]。

Cchla=(11.85E664-1.54E647-0.08E630)

×10/V

(1)

Cchlb=(21.03E647-5.43E664-2.66E630)

×10/V

(2)

Ctch1=(20.21E647+8.02E664) ×10/V

(3)

式中：Cchla、Cchlb、Ctch1—葉綠素a、b、總葉綠素的質量濃度，mg/L；E630、E647、E664—吸光度值，nm，V—試驗用藻液體積，mL。

②總蛋白質含量：稱取 0.1～0.3 g被測樣品包于特制錫箔中,并置于自動落樣器上。樣品在燃燒反應爐 (960 ℃)、通氧量為 170 mL/min條件下充分燃燒 300 s，直至氧剩余量達到 12 %時停止燃燒。燃燒反應爐中的試劑依次為 280 g氧化銅，13 g銀絲，15 g鉑。燃燒爐中的產物進入 TC 檢測器(Rapid N III，Ele-mentar公司)檢測[16]。

③可溶性糖含量：取提取液 1 mL于刻度離心管內，加 5 mL蒽酮試劑，擰上蓋子，沸水浴10 min之后將離心管冰水浴或用自來水沖洗至室溫， 20 min后用紫外分光光度計測 630 nm處的吸光度值，比對標準曲線，計算可溶性糖含量[17]。

1.4 數據處理與統計

(1)數據換算處理：生產力Px和比生長速率(μ)通過下述公式進行計算[18]：

Px= (Xm-Xi)/Tc

(4)

μ= (lnXm-lnXi)/Tc

(5)

式中：Px—生產力，g/(L·d)，Xi—初始生物量質量濃度， g/ L，Xm—最大生物量質量濃度，g/L，Tc—與最大生物量質量濃度有關的培養時間，d。

(2)統計分析：試驗所得數據均以平均值±標準差(Mean±SD)進行表示。采用Microsoft Excel 2016和DPS 14.5軟件進行數據處理和統計分析。采用單因素方差分析法進行差異性顯著分析，當P<0.05時認為差異顯著。

2 結果

2.1 不同養殖模式下湛江等鞭金藻生產力和比生長速率的差異

管道式光生物反應器培養模式下的湛江等鞭金藻生產力和比生長速率顯著優于聚乙烯桶和傳統水泥池培養模式(P<0.05，表1)。管道式光生物反應器的生產力和比生長速率最高，分別為0.054 3±0.000 8 g /(L·d)、0.276 7±0.001 0 d-1，其次為傳統水泥池模式，分別為0.019 3±0.000 3 g/(L·d)、0.200 7±0.001 2 d-1。而聚乙烯桶模式相對最低，分別為0.016 3±0.000 6 g /(L·d)、0.190 3±0.002 4 d-1。

表1 不同養殖模式下湛江等鞭金藻生產力和比生長速率的差異

2.2 不同養殖模式下湛江等鞭金藻生長密度的差異

不同養殖模式下的湛江等鞭金藻生長整體呈先緩慢增長后快速增長，隨后呈穩定狀態，最后開始降低的趨勢，且管道式光生物反應器模式趨勢變化最為明顯(圖2)。

圖2 3種養殖模式對湛江等鞭金藻生長密度的影響

管道式光生物反應器模式在第11 天開始進入快速生長期(1.46±0.04)×106cells/mL，并在第13 天細胞密度達峰值(3.70±0.11)×106cells/mL且開始進入平穩期；傳統水泥池和聚乙烯桶模式生長趨勢相對平緩，在第13天和第14 天分別達到峰值(1.42±0.01)×106cells/mL、(1.18±0.04)×106cells/mL，但顯著低于管道式光生物反應器模式峰值(P< 0.05)。

2.3 不同養殖模式下湛江等鞭金藻葉綠素a、b和總葉綠素含量的差異

不同養殖模式下的湛江等鞭金藻葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素質量濃度整體都呈先緩慢增長后快速增長，隨后呈穩定狀態，最后開始降低的趨勢，且管道式光生物反應器模式趨勢變化最為明顯(圖3、4、5)。

圖3 3種養殖模式對湛江等鞭金藻葉綠素a的影響

圖4 3種養殖模式對湛江等鞭金藻葉綠素b的影響

圖5 3種養殖模式對湛江等鞭金藻總葉綠素的影響

管道式光生物反應器模式中葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素在第9天開始進入快速增長期(0.28 mg/L、0.29 mg/L、0.58 mg/L)，并在第14天葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量達峰值(0.94 mg/L、0.95 mg/L、1.90 mg/L)且開始進入平穩期；傳統水泥池和聚乙烯桶模式葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素增長趨勢相對平緩，且葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素質量濃度的峰值顯著低于管道式光生物反應器模式(P< 0.05)。傳統水泥池在養殖第13天葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素質量濃度分別達峰值0.36 mg/L、0.35 mg/L、0.73 mg/L；聚乙烯桶模式在養殖第14天葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素質量濃度分別達峰值0.31 mg/L、0.31 mg/L、0.63 mg/L。

2.4 不同養殖模式下湛江等鞭金藻和胞內有機物含量對比

管道式光生物反應器培養模式下的湛江等鞭金藻有機物質量濃度最佳，其次為傳統水泥池模式，且有機物含量之間存在顯著性差異(表2，P< 0.05)。管道式光生物反應器的有機物質量濃度最高，最大生物量干重、最高總蛋白質含量和最大可溶性糖含量分別可達0.727 0±0.009 8 g /L、159.125 5±2.169 7 mg/L，42.862 7±0.586 6 mg/L，顯著高于傳統水泥池模式(0.274 0±0.004 3 g/L、58.021 5±0.952 4 mg/L，15.528 3±0.257 5 mg/L)，和聚乙烯桶模式(0.238 5±0.007 4 g /L、50.453 4±1.633 1 mg/L，13.482 3±0.441 5 mg/L)。而管道式光生物反應器，聚乙烯桶和傳統水泥池模式的單細胞胞內有機物含量之間沒有顯著性差異(表3)。

表2 湛江等鞭金藻在聚乙烯桶、管道式光生物反應器和傳統水泥池培養下的有機物之間的比較

表3 湛江等鞭金藻在聚乙烯桶、管道式光生物反應器和傳統水泥池培養下的單細胞胞內有機物之間的比較

3 討論

3.1 湛江等鞭金藻3種培養模式比較

微藻培養模式各有利弊，為了取長補短、相互彌補，對各種培養模式不斷地優化成為近幾年的研究熱點。跑道水泥池模式的使用在微藻培養發展過程中實現了擴大和培養的嘗試，其優點在于可將投入和運營成本降到最低[19-21]。此外聚乙烯桶模式因其具有體積小、易清理的優點，常在水產養殖場中被應用，是微藻生物餌料擴培的中間模式[22]。管道式光生物反應器是近年來較受水產生產單位歡迎的微藻室外培養的新型模式，其可利用玻璃管道使微藻在生產過程中充分利用太陽光能，使藻細胞的受光面積達到最大，并可降低受其他因素污染藻液的可能性[10,23-24]。本研究表明，管道式光生物反應器是適合戶外大規模微藻培養的養殖模式，這與李磊等[10]關于光生物反應器培養微藻的研究結果以及趙新亞等[25]對小球藻和新月菱形藻柱式光生物反應器連續式培養研究結果較為一致。由此可見光生物反應器培養模式與常見的三角瓶一級培養、吊袋二級培養和水泥池三級培養系統相比具有明顯的優越性，且具有較高的微藻繁殖效率。

3.2 湛江等鞭金藻3種培養模式對生產力和色素含量影響分析

生產力和比生長速率是評估微藻生產可行性的重要參數之一，本研究表明，管道式光生物反應器生產模式的生產力和比生長速率顯著高于聚乙烯桶和傳統水泥池模式，即管道式光生物反應器生產模式的生產效果最佳。3種不同培養模式的比較試驗是同時在室外開展的，造成生產效果存在差異的主要原因可能在于光照利用的充分與否。隨培養時間的推移，藻液單細胞濃度在不斷升高，傳統水泥池和聚乙烯桶培養模式由于養殖容器深度等問題使得單個藻體細胞所受到光照條件在逐漸減弱，繼而限制了其生長，而管道式光生物反應器相對而言即使在養殖后期依然可有效保障藻細胞充足且有效的光照條件[26-28]。與董學衛等[5]關于柱式反應器研究結果相比，管道式光生物反應器的生產力較次于柱式反應器，其原因可能在于培養規模的差異，其所用柱式反應器培養體積較小，更適于室內保種，而本研究所用管道式光生物反應器規模相對較大，更適用于室外培養，同時在和其柱式反應器初始藻密度相差很大的情況下，它們的比生長速率仍然十分接近，可見本研究所用的管道式光生物反應器是具有優勢的。

細胞光合速率決定了藻類生長速度，而光合速率又取決于光合色素的含量，因此光合色素含量變化能反映微藻生長發育情況[29]。

本研究發現，利用管道式光生物反應器規模化培養金藻時更利于其葉綠素及胞內有機物的積累。朱永梅等[30]研究中利用不同光合光子強度培養湛江等鞭金藻說明，光照強度在一定的范圍內，逐漸升高是有利于微藻生長，本研究所用管道式光生物反應器受光面積更大，單個微藻更容易接受光照，相較于其他兩種模式更有利于微藻培養。如果假設培養系統之間的葉綠素數量和質量沒有差異，并且所有系統處于相同曲線水平，這原則上表達了管道式光生物反應器系統中湛江等鞭金藻的發育狀況更好且應優選用于葉綠素的生產。且在相似的鹽度下，本研究中管道式光生物反應器中生產的葉綠素含量和藺紅蘋等[1]研究中的葉綠素含量一致。此外，本研究發現試驗周期內管道式光生物反應器、聚乙烯桶和傳統水泥池的湛江等鞭金藻有機物的質量濃度并不一致，管道式光生物反應器中湛江等鞭金藻總蛋白質含量和可溶性糖含量顯著高于聚乙烯桶和傳統水泥池培養模式，這可能是由于管道式光生物反應器更利于藻體接受光照所致[5]。與黃振華等[31]使用小型錐形瓶培養的湛江等鞭金藻的蛋白質含量相比，本研究使用的管道式光生物反應器要低于其使用的用于保種的小型錐形瓶，但二者模式相差較大，所以用于規?；a的管道式光生物反應器的蛋白質含量是具有可比性的。傳統的微藻室外規?；囵B方式操作煩瑣，生產效率低，藻的質量不能得到保障，相關研究結果表明，管道式光生物反應器可有效避免這些問題，更利于微藻規?；囵B效率的提高，但需要較精細的技術運營管理。

4 結論

管道式光生物反應器培養模式下的藻細胞生長、繁殖速度快，可快速進入指數生長期，具有藻液細胞濃度大，富含優質生物質的優點，餌料質量可得到強化。管道式光生物反應器為在戶外低成本高效開發微藻提供了基礎條件。

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