低溫貯藏過程中水牛肉蛋白質(zhì)的變化

丘 靜

秦德麗1，2

劉純友1,2，3

孫庭廣1，2

羅其勇1，2

(1. 廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2. 廣西柳州螺螄粉工程技術(shù)研究中心，廣西 柳州 545006; 3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070)

水牛(Bubalusbubalis)是一種生長在熱帶、亞熱帶地區(qū)的特色畜種，是中國黃牛、牦牛和水牛三大牛種中唯一能適應(yīng)熱帶、亞熱帶地區(qū)高溫高濕極端環(huán)境的特殊牛種[1]。亞洲是全球水牛的主產(chǎn)區(qū)，占世界水牛種群數(shù)量的97% 以上[2]。與普通黃牛肉相比，水牛肉色澤更加鮮紅、蛋白質(zhì)含量高、脂肪和膽固醇含量較低，食用品質(zhì)比黃牛肉更高[2-3]。

蛋白質(zhì)是肉類的主要營養(yǎng)成分之一，常溫條件下蛋白質(zhì)很容易發(fā)生氧化，進(jìn)而使蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致肉類的色澤、嫩度、保水性和質(zhì)地等食用品質(zhì)嚴(yán)重下降[4-5]。研究[6-7]表明，蛋白質(zhì)在低溫情況下依然會發(fā)生劣變。目前，關(guān)于冷藏或凍藏過程中蛋白質(zhì)氧化研究主要集中于普通黃牛肉[6-8]和牦牛肉[9]，而有關(guān)低溫貯藏過程中中國沼澤型水牛肉蛋白質(zhì)變化國內(nèi)外未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。研究擬以水牛肉為研究對象，分別將其于4，-18，-60 ℃貯藏，通過測定蛋白質(zhì)含量、表面疏水性、總巰基含量、游離巰基含量及羰基值等蛋白質(zhì)指標(biāo)，同時進(jìn)行指標(biāo)間的相關(guān)性分析，闡明低溫貯藏過程中水牛肉蛋白質(zhì)的變化規(guī)律，以期為生鮮水牛肉的貯藏保鮮及肉類品質(zhì)變化機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水牛肉：背最長肌，廣西冠業(yè)投資發(fā)展有限公司柳州東環(huán)分公司；

鹽酸胍、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、溴酚藍(lán)、十二烷基磺酸鈉、尿素、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、DTNB、氯化鉀、EDTA、2,4-二硝基苯肼、鹽酸、硫酸等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

紫外—可見分光光度計：UV-2600型，島津儀器蘇州有限公司；

高速冷凍離心機：Avanti J-26 XPI型，美國貝克曼庫爾特有限公司；

超低溫冰箱：DW-86L386型， 青島海爾特種電氣有限公司；

冰箱：BCD-518WEC型， 中科美菱低溫科技有限公司；

電子分析天平：AE2204型，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；

pH計：PHS-25CW型，上海般特儀器制造有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4S型，江蘇金怡儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品貯藏方法 將新鮮水牛肉(背最長肌)用刀去除肉眼可見的筋腱、脂肪和結(jié)締組織，將樣品切成質(zhì)量400 g，厚度3 cm的肉塊，再將樣品用聚乙烯薄膜包裹，隨機分成3組，分別于4，-18，-60 ℃貯藏。肉樣于冷藏溫度(4 ℃)下分別貯藏0，2，4，6，8，10，12 d，于凍藏溫度(-18，-60 ℃)下分別貯藏1，5，10，15，20，25，30 d，冷凍樣品先用保鮮膜包裹好再用自來水流水方法進(jìn)行解凍，當(dāng)肉樣中心溫度達(dá)4 ℃時解凍完畢，測定肉樣的蛋白質(zhì)含量、表面疏水性、總巰基含量、游離巰基含量、羰基值等蛋白質(zhì)品質(zhì)指標(biāo)，每個樣品平行3次取平均值。

1.3.2 總蛋白質(zhì)含量測定 根據(jù)GB 5009.5—2016。

1.3.3 表面疏水性測定

(1) 肌原纖維蛋白提取：參照Park等[10]的方法并修改。先將肉樣切碎稱取5 g，加入20 mL磷酸鹽緩沖液(含0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA, 6.1 mmol/L NaH2PO4，3.9 mmol/L Na2HPO4·H2O, pH 7.0)，8 000 r/min均質(zhì)30 s；4 ℃、3 650 r/min離心15 min，棄去上清液；粗提的肌原纖維沉淀物用4倍體積的磷酸鹽緩沖液洗滌2次，再用4倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液洗滌3次，并用4層紗布過濾，去除肉樣中的結(jié)締組織；用0.1 mol/L的HCl將肌原纖維蛋白溶液的pH值調(diào)至6.0，離心，得肌原纖維蛋白備用。

(2) 表面疏水性：參照Chelh等[11]的方法，按式(1)計算溴酚藍(lán)結(jié)合量。

(1)

式中：

X——溴酚藍(lán)結(jié)合量，μg；

A0——空白對照組在595 nm處的吸光度值；

A1——試驗組在595 nm處的吸光度值。

1.3.4 總巰基含量測定 參照周果等[12]的方法。

1.3.5 游離巰基含量測定 采用Rysman等[13]的方法并修改。取1.0 mL 肌原纖維蛋白溶液，加入4.5 mL Tris-HCl 溶液(0.2 mol/L，2.0% SDS，10 mmol/L EDTA，pH 6.8)，混勻，加入1.0 mL 0.2 mol/L的Tris-HCl 溶液(0.2 mol/L，0.1% DTNB，pH 8.0)，40 ℃水浴25 min，測定412 nm處吸光度值。用0.6 mol/L 的KCl溶液做空白對照。按式(2)計算游離巰基含量。

(2)

式中：

X——游離巰基含量，mol/mg；

D——稀釋倍數(shù)，為10；

13 600——分子吸光系數(shù)；

C——樣液的質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.6 羰基含量測定 參照馬麗華等[14]的方法并修改。稱取3.0 g切碎的肉樣，加入30 mL Tris-HCl溶液，8 000 r/min 均質(zhì)30 s，4 000 r/min離心15 min，取1.0 mL 上清液，加入1.0 mL 2,4-二硝基苯肼溶液(0.01 mol/L)混勻，黑暗環(huán)境下反應(yīng)60 min，加入1.0 mL三氯乙酸溶液(20%)，4 000 r/min離心15 min，棄去上清液；沉淀中加入4.0 mL鹽酸胍(6.0 mol/L)，37 ℃水浴15 min，5 000 r/min離心10 min，測定370 nm處吸光度值。按式(3)計算羰基含量。

(3)

式中：

X——羰基含量，nmol/mg；

D——稀釋倍數(shù)；

A370 nm——370 nm處吸光度值；

854——所有醛類吸光系數(shù)的平均值，A/mmol；

C——樣品的質(zhì)量濃度，g/mL。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析、鄧肯氏多重差異顯著性分析及皮爾遜分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫貯藏過程中水牛肉總蛋白質(zhì)含量變化

由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，不同貯藏溫度下水牛肉中總蛋白質(zhì)含量不斷下降。4 ℃下冷藏第2天，總蛋白含量為23.55 g/100 g，下降幅度僅為2.57%，隨后總蛋白質(zhì)含量幾乎呈直線下降；貯藏第6天，總蛋白質(zhì)含量從最初24.20 g/100 g下降至17.55 g/100 g，下降幅度高達(dá)27.48%；貯藏第10天，總蛋白質(zhì)含量15.49 g/100 g，下降幅度達(dá)35.98%。貯藏第10天，-18，-60 ℃下的總蛋白含量分別為18.77，19.93 g/100 g，下降幅度為22.43%，17.63%，顯著低于4 ℃的(P<0.05)。前期水牛肉蛋白質(zhì)含量下降快，主要是由于貯藏前期肉樣中蛋白質(zhì)酶活性較高；但隨著貯藏時間的延長，蛋白酶活性不斷降低，故貯藏后期水牛肉中蛋白質(zhì)含量下降變得平緩。Shafi等[15]研究發(fā)現(xiàn)-18 ℃凍藏0 d，鰱魚肉蛋白質(zhì)含量為20.09 g/100 g，經(jīng)90 d冷凍貯藏后蛋白質(zhì)含量降至17.10 g/100 g，下降幅度達(dá)14.18%，其下降幅度小于凍藏的水牛肉。隨著貯藏時間的延長，低溫貯藏過程中水牛肉中蛋白質(zhì)含量不斷降低，可能是由于在肌肉內(nèi)源酶的作用下，水牛肉蛋白質(zhì)發(fā)生氧化降解，且貯藏溫度越高，肌肉中內(nèi)源酶活性越強，蛋白質(zhì)降解速度越快，故4 ℃冷藏條件下水牛肉總蛋白質(zhì)含量下降速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于凍藏條件的。綜上，溫度對低溫貯藏過程中水牛肉總蛋白質(zhì)含量的變化有顯著影響，不同肉類(水牛肉、魚肉)低溫貯藏過程中蛋白質(zhì)含量下降存在較大差異，可能與動物種類、品種、肌肉部位、肌纖維大小類型及內(nèi)源酶種類及活性有關(guān)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 低溫貯藏過程中水牛肉總蛋白質(zhì)含量變化

2.2 低溫貯藏過程中水牛肉表面疏水性變化

由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，水牛肉的表面疏水性總體呈上升趨勢， 其中4 ℃下的表面疏水性從第4天開始幾乎呈直線上升，且顯著高于-18，-60 ℃的(P<0.05)。4 ℃下冷藏0～4 d，表面疏水性增加緩慢，隨后呈直線快速增長；貯藏第10天，表面疏水性達(dá)10.74 μg，增加幅度為初始值(0.92 μg)的10.6倍。-18，-60 ℃下貯藏第10天，表面疏水性增加幅度較為緩慢，分別為初始值的1.6，0.3倍，顯著低于4 ℃冷藏的(P<0.05)；隨后逐漸增大，貯藏第30天，二者的增加幅度分別為初始值(0.92 μg)的5.8，4.8倍，且-18 ℃下的表面疏水性始終高于-60 ℃的。貯藏過程中水牛肉表面疏水性不斷增加，主要是由于水牛肉蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象被羥基自由基氧化而發(fā)生改變，導(dǎo)致埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性氨基酸暴露[16-17]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 低溫貯藏過程中水牛肉表面疏水性的變化

2.3 低溫貯藏過程中水牛肉總巰基含量變化

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，不同貯藏溫度下水牛肉總巰基含量總體呈下降趨勢。4 ℃下貯藏0～8 d，總巰基含量總體呈直線快速下降，從最初的51.05 nmol/mg蛋白質(zhì)下降至42.23 nmol/mg蛋白質(zhì)，下降幅度達(dá)17.28%；隨后下降速度趨于平緩。-18，-60 ℃下凍藏0～5 d，總巰基含量下降較為平緩，下降幅度分別為2.68%，1.49%；隨后兩者下降幅度快速增加；貯藏第30天，兩者分別為42.08，46.35 nmol/mg蛋白質(zhì)，下降幅度達(dá)17.57%和9.20%，且-60 ℃下的下降幅度始終低于-18 ℃的(P<0.05)。Tao等[18]研究發(fā)現(xiàn)灘羊肉中總巰基含量隨貯藏時間的增加不斷下降，且貯藏溫度越高巰基含量越低。貯藏過程中水牛肉中巰基含量不斷降低，可能是由于水牛肉中巰基被活性氧(ROS)氧化所致，且?guī)€基含量的降低不僅與參與蛋白質(zhì)氧化的酶活性有關(guān)，還與冰晶對肌原纖維結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)[19]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 低溫貯藏過程中水牛肉總巰基含量的變化

2.4 低溫貯藏過程中水牛肉游離巰基含量變化

由圖4可知，隨著貯藏時間的延長，水牛肉的游離巰基含量總體呈下降趨勢，其中4 ℃下的下降幅度顯著高于-18，-60 ℃的。4 ℃下貯藏第2天，游離巰基含量為39.21 nmol/mg蛋白質(zhì)，下降幅度僅為10.60%，隨后呈急速下降趨勢；貯藏第10天，游離巰基含量為28.31 nmol/mg蛋白質(zhì)，下降幅度高達(dá)35.45%。貯藏第5天，-18，-60 ℃ 下的游離巰基含量分別為38.32，39.61 nmol/mg蛋白質(zhì)，下降幅度為12.63%和9.69%；隨后下降速度不斷加快；貯藏第30天，-18，-60 ℃下的游離巰基含量分別為28.35，29.55 nmol/mg蛋白質(zhì)，下降幅度高達(dá)35.36% 和32.63%，-18 ℃下的下降幅度始終高于-60 ℃ 的。貯藏過程中水牛肉游離巰基含量不斷下降，主要是由于活性氧直接攻擊水牛肉蛋白質(zhì)中半胱氨基酸殘基上的巰基，并將巰基轉(zhuǎn)變成二硫鍵及磺酸、亞磺酸、硫代亞磺酸等硫醇氧化產(chǎn)物所致[13]。

2.5 低溫貯藏過程中水牛肉羰基含量變化

由圖5可知，隨著貯藏時間的延長，不同貯藏溫度下水牛肉的羰基含量總體呈上升趨勢。4 ℃冷藏0～3 d，羰基含量增長相對較為緩慢，貯藏第4天，羰基含量為2.10 nmol/mg蛋白質(zhì)，增幅達(dá)16.02%；隨后呈直線快速上升；第10，12天，羰基含量分別為3.26，3.96 nmol/mg蛋白質(zhì)，增幅分別為初始值的0.81，1.19倍。-18，-60 ℃下貯藏0～5 d，羰基含量分別為2.05，1.91 nmol/mg蛋白質(zhì)，增加幅度相對緩慢；隨后增加幅度逐漸加快；第30天，二者的羰基含量分別為3.76，3.51 nmol/mg蛋白質(zhì)，增幅分別為初始值的1.08，0.94倍。Rysman 等[13]研究發(fā)現(xiàn)隨著冷藏時間的不斷延長，普通牛肉餅中羰基含量不斷增加，冷藏7 d 后，羰基含量增加幅度為初始值的0.65倍。貯藏過程中水牛肉羰基含量不斷增加，可能是由于冷藏或凍藏破壞了肌肉的超微結(jié)構(gòu)，并釋放自由基，導(dǎo)致蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基酸中的氨基和亞氨基氧化形成羰基化合物所致[20]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 低溫貯藏過程中水牛肉游離巰基含量的變化

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 低溫貯藏過程中水牛肉羰基含量的變化

2.6 蛋白質(zhì)品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性

由表1～表3可知，冷藏(4 ℃)和凍藏(-18，-60 ℃)過程中水牛肉總蛋白質(zhì)含量與表面疏水性、羰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。低溫貯藏過程中水牛肉總蛋白質(zhì)含量與總巰基含量、游離巰基含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。表面疏水性與總巰基含量、游離巰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，但與羰基含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。低溫貯藏過程中總巰基含量與總蛋白含量、游離巰基含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，但與表面疏水性、羰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；游離巰基含量與總蛋白、總巰基含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，但與表面疏水性呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。低溫貯藏過程中羰基含量與表面疏水性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，但與總蛋白、總巰基和游離巰基含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。綜上，冷藏或凍藏條件下，水牛肉蛋白質(zhì)品質(zhì)指標(biāo)之間具有良好的相關(guān)性。

表1 4 ℃冷藏過程中水牛肉蛋白質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)性?Table 1 Correlation analysis between various protein indicators during 4 ℃ refrigerated storage

表2 -18 ℃凍藏過程中水牛肉蛋白質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)性?Table 2 Correlation analysis between various protein indicators during -18 ℃ frozen storage

表3 -60 ℃凍藏過程中水牛肉蛋白質(zhì)指標(biāo)間的相關(guān)性?Table 3 Correlation analysis between various protein indicators during -60 ℃ frozen storage

3 結(jié)論

試驗表明，3種貯藏溫度下，隨著貯藏時間的不斷延長，水牛肉的總蛋白質(zhì)、總巰基、游離巰基含量總體呈下降趨勢，但表面疏水性和羰基含量不斷上升。溫度對貯藏過程中水牛肉蛋白質(zhì)的氧化降解有顯著影響，降低貯藏溫度在一定程度上可以抑制蛋白質(zhì)的氧化降解并有效延長生鮮水牛肉的貨架期。3種貯藏溫度下，-60 ℃凍藏的水牛肉蛋白質(zhì)的氧化降解程度低，肉品質(zhì)保持效果好。后續(xù)可從脂質(zhì)角度研究貯藏過程中水牛肉品質(zhì)的變化規(guī)律。