硫酸鹽還原菌原位合成納米硫化亞鐵還原Cr（Ⅵ）

胡 凡，陳元彩，胡勇有，程建華

（華南理工大學 環境與能源學院工業聚集區污染控制與生態修復教育部重點實驗室，廣東 廣州 510006）

鉻污染物主要來源于電鍍、染料、制革、木材防腐等行業排放的工業廢水，常以Cr（Ⅵ）和Cr（Ⅲ）兩種價態存在［1］。Cr（Ⅵ）具有四面體結構，可通過細胞膜進入細胞內，破壞生物體的細胞結構，其生物毒性是Cr（Ⅲ）的100倍［2］。因此，處理含鉻廢水的主要目標是將Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ）。傳統的物理化學法費用高，存在二次污染。生物法因其兼具經濟與環境效益而受到廣泛的重視［3］，但微生物代謝過程中緩慢的電子傳遞速率以及重金屬的生物毒性效應限制了生物修復在廢水處理領域的應用［4］。

納米硫化亞鐵（Nano-FeS）由于具有良好的吸附性、還原性被廣泛應用于水中污染物的處理。生物合成的Nano-FeS不僅能克服納米粒子不穩定、易團聚的缺陷，還能彌補細胞膜導電性差的短板［5］，為微生物的胞外電子傳遞提供電子傳輸通道，加快胞外呼吸速率［6］。因此利用微生物合成Nano-FeS是一種很有前景的廢水原位處理方法。

本研究利用硫酸鹽還原菌（SRB）原位合成Nano-FeS，構建Nano-FeS協同SRB（Nano-FeS@SRB）體系還原Cr（Ⅵ），為含Cr（Ⅵ）廢水的處理提供新的思路和理論依據。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑和儀器

FeCl2·4H2O、NaOH、H2SO4（98%（w））、重鉻酸鉀、卡那霉素：均為分析純。

MLS-3705型高壓滅菌鍋：日本三洋公司；LGJ-10型冷凍干燥機：北京松源華興公司；DR 6000型紫外-可見分光光度計：美國哈希公司；PH3C型臺式pH計：上海儀點科技儀器股份有限公司；BT125D型電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司；CHI832D型電化學工作站：上海辰華儀器有限公司。

基礎培養基溶液：Na2SO40.72 g/L，K2HPO4·3H2O 0.60 g/L，NH4Cl 1.00 g/L，MgCl2·6H2O 0.06 g/L，乳酸鈉2 mL/L。

1.2 Nano-FeS@SRB體系的構建

配制基礎培養基溶液1 L，用0.5 mol/L的NaOH溶液和1.0 mol/L的H2SO4調節pH至7.0。為避免乳酸鈉在高溫條件下發生反應，將乳酸鈉放入超凈臺開啟紫外燈滅菌30 min以上，其他培養基物質在121 ℃滅菌30 min，將乳酸鈉與其他培養基物質混合后再加入0.15 g FeCl2·4H2O。

取200 mL上述培養基溶液置于250 mL的厭氧瓶中，將培養好的SRB加入培養基中，使最終OD600= 0.1。向厭氧瓶中通入氮氣15 min后立即封閉，并將其置于恒溫搖床中培養，溫度為30 ℃，轉速為140 r/min。7~9 d后，將得到的Nano-FeS@SRB溶液在厭氧工作臺中用氮氣吹脫過的去離子水洗滌，離心并收集。

1.3 Nano-FeS@SRB體系還原Cr（Ⅵ）

取SRB和Nano-FeS@SRB溶液各10 mL，用去離子水洗滌，離心吸除上清液后，分別加入200 mL Cr（Ⅵ）質量濃度為10 mg/L或20 mg/L的K2Cr2O7溶液（模擬含鉻廢水）。每隔一定時間吸取10 mL上清液測定溶液中Cr（Ⅵ）的質量濃度。

1.4 分析表征方法

采用二苯碳酰二肼分光光度法［7］（GB 7467—1987）測定溶液中Cr（Ⅵ）的質量濃度；采用考馬斯亮藍分光光度法［8］測定蛋白質濃度；采用X射線衍射儀（Empyrean型，荷蘭帕納科公司）和X射線光電子能譜儀（UlraDLD型，英國Kratos公司）對反應前后的物質進行表征。

1.5 Nano-FeS對微生物電子傳遞性能的影響實驗

1.5.1 電化學實驗

采用循環伏安法（CV）和恒電位法（I-t）測定微生物的電化學性能。采用標準三電極電解池，使用鉑絲作對電極、玻碳電極為工作電極、Ag/AgCl電極為參比電極［9］，用基礎培養基溶液（pH=7.0）作電解液。實驗前對玻碳電極進行拋光打磨，并將電解池中的電解液通氮氣15 min，去除其中的氧氣后，將通氣管提高到液面上方繼續通氮氣以保持厭氧環境。隨后吸取洗滌離心后的SRB和Nano-SRB@FeS溶液各10 μL至工作電極表面，并加入適量1% Nafion溶液固定，待自然晾干固定后分別進行測試。循環伏安法中設置電勢增量6 mV，脈沖幅度60 mV，脈沖寬度0.2 s，掃描范圍-0.8~0.8 V，掃描速率10 mV/s。恒電位法中電壓控制在-0.40 V。

1.5.2 電子傳遞抑制劑實驗

取SRB和Nano-FeS@SRB溶液各10 mL，洗滌離心吸除上清液后分別加入K2Cr2O7溶液。通過加入不同的電子傳遞抑制劑（0.2 mmol/L雙香豆素；0.1 mmol/L辣椒素和0.1 mmol/L魚藤酮混合物；0.2 mmol/L噁唑菌酮）阻斷Cr（Ⅵ）還原過程中的生物電子傳遞，來判斷Nano-FeS的主要作用位點。

1.6 Nano-FeS@SRB體系還原Cr（Ⅵ）的單因素實驗

分別考察Cr（Ⅵ）初始質量濃度（5，10，15，20，25 mg/L）、溫度（25，30，35，40 ℃）和pH（5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）對Nano-FeS@SRB體系還原Cr（Ⅵ）效果的影響，24 h后測定溶液中殘留Cr（Ⅵ）質量濃度，并計算Cr（Ⅵ）去除率。

2 結果與討論

2.1 表征結果

Nano-FeS@SRB的XRD譜圖見圖1。由圖1可見：在2θ為16.35°、28.52°和50.50°處有四方硫鐵礦FeS的特征峰，分別對應著FeS在（010）、（111）和（122）晶面的衍射峰，證實了FeS的形成。結晶性差是由于中性pH條件和較短的生長周期導致的［10-11］。

圖1 Nano-FeS@SRB的XRD譜圖

Nano-FeS@SRB的XPS譜圖見圖2。由圖2a可見：Fe 2p的峰位置在709.6，713.2，725.6 eV處，分別對應 Fe（Ⅲ）—S、Fe（Ⅲ）—O和Fe（Ⅱ）—S［12-15］，其中FeS質量分數為53%，表明在制備過程中FeS表面發生了部分氧化。由圖2b可見：S 2p的峰位置在161.0，162.2，163.8，168.7 eV處，分別對應S2-、Sn2-、S0和SO42-，其中S0是SRB異化硫酸鹽過程中的中間產物。由圖2c可見：C 1s的峰位置在284.9，286.2，288.0 eV處，分別對應C—C、C—O和C=O，可能與細胞表面的生物組分相關［16］。

圖2 Nano-FeS@SRB的XPS譜圖（Fe 2p（a）、S 2p（b）和C 1s（c））

2.2 Nano-FeS@SRB體系還原Cr（Ⅵ）的性能

SRB和Nano-FeS@SRB體系中Cr（Ⅵ）和蛋白質質量濃度的變化見圖3。由圖3a和圖3b可見：當Cr（Ⅵ）初始質量濃度為10 mg/L時，SRB和Nano-FeS@SRB體系對Cr（Ⅵ）的去除效果符合準一級動力學模型，SRB體系中Cr（Ⅵ）的反應速率常數為2.47×10-6s-1，而Nano-FeS@SRB體系中Cr（Ⅵ）的反應速率常數為2.60×10-4s-1，比SRB高兩個數量級，完全去除時間從5 d降至7 h，說明Nano-FeS@SRB體系具有較高的Cr（Ⅵ）還原能力。由圖3a可見，前2 d內SRB體系中蛋白質質量濃度沒有明顯提升，SRB細胞生長受到抑制；而圖3d中Nano-FeS@SRB體系中細胞生長延遲期消失，說明Nano-FeS可以有效緩解Cr（Ⅵ）對SRB細胞生長的抑制作用。

由圖3c和圖3d可見：當Cr（Ⅵ）初始質量濃度為20 mg/L時，在第2天加入卡那霉素（一種阻止蛋白質合成并最終導致細胞死亡的氨基糖苷類抗生素），微生物的生長立即停止，Cr（Ⅵ）的反應速率常數由1.07×10-5s-1急劇降至2.08×10-8s-1后停止，表明Nano-FeS@SRB體系中Cr（Ⅵ）的還原是微生物介導的過程。

圖3 SRB和Nano-FeS@SRB體系中Cr（Ⅵ）和蛋白質質量濃度的變化

還原產物的XPS譜圖見圖4。其中FeS的質量分數為47%，可見FeS在還原Cr（Ⅵ）后并沒有發生顯著損耗，主要在于細胞生物質對納米粒子的穩定作用和SRB的電子傳遞能力。由圖4c可見：Cr 2p3/2在576.8 eV和577.7 eV處的峰分別對應Cr2O3和Cr（OH）3；在587.1eV處的峰對應Cr 2p1/2中的FexCr1-x（OH）3或Fe（OH）3-Cr（OH）3［17］，表明還原產物中的鉻主要以Cr（OH）3的形式存在，少量以Cr2O3的形式存在。產物中S0的質量分數為27%，說明在Cr（Ⅵ）存在的條件下，部分FeS表面的硫化物被氧化為S0；SO42-的質量分數為23%，說明Cr（Ⅵ）和SO42-均可以作為電子受體，接受來自細胞代謝產生的電子。

圖4 還原產物的XPS譜圖（S 2p（a）、Fe 2p（b）和Cr 2p（c））

2.3 Nano-FeS對微生物電子傳遞性能的影響

2.3.1 電化學性能分析

SRB和Nano-FeS@SRB的I-t曲線和循環伏安曲線見圖5。由圖5a可見：在SRB的實驗組中，電流的增加可以忽略不計；在Nano-FeS@SRB的實驗組中，在實驗0.65 h時電流迅速增加至50 μA，表明Nano-FeS的加入增強了SRB的胞外電子傳遞；在實驗1.80 h加入可使細胞滅活的卡那霉素時，電流在微生物應激反應下急劇增加到54 μA后立即降至8 μA，說明陰極產生的電流與微生物細胞代謝有關。

由圖5b可見：在SRB的實驗組中沒有觀察到明顯的氧化還原峰；在Nano-FeS@SRB實驗組中，除-0.8 V處氫還原峰外，還在-0.4 V處出現了明顯的還原峰，說明Nano-FeS的存在對SRB內的氧化還原反應具有強化作用。電化學實驗表明，Nano-FeS增強了SRB的胞外電子傳遞。

圖5 SRB和Nano-FeS@SRB的I-t曲線 （a）和循環伏安曲線（b）

2.3.2 電子傳遞抑制劑的作用

不同抑制劑條件下的Cr（Ⅵ）去除率和抑制率見圖6。由圖6a可見：添加雙香豆素、魚藤酮與辣椒素的混合物及噁唑菌酮后，SRB對Cr（Ⅵ）的去除率從38%下降至15%、24%和11%，其抑制率分別達到58.39%、36.29%和71.07%，主要是因為競爭性抑制劑雙香豆素可以與復合體I結合，阻礙電子由復合體I向醌池的傳遞；而噁唑菌酮可以抑制電子向外膜細胞色素c的傳遞。Nano-FeS@SRB體系中，雙香豆素和噁唑菌酮的抑制作用得到緩解，抑制率分別降至11.59%和5.71%，主要是由于導電性納米粒子具有高親和力，可以附著于復合體I，占據抑制劑雙香豆素的結合位點，以促進細胞電子轉移，并且Nano-FeS還可以作為電子導管代替受抑制的細胞色素c接受細胞代謝產生的電子并將其傳遞給Cr（Ⅵ）。電子傳遞抑制劑實驗結果說明Nano-FeS對細胞的電子傳遞具有積極作用，可以作為電子穿梭體將細胞代謝產生的電子傳遞給胞外Cr（Ⅵ），實現Cr（Ⅵ）到Cr（Ⅲ）的還原。

圖6 不同抑制劑條件下的Cr（Ⅵ）去除率（a）和抑制率（b）

2.4 Nano-FeS@SRB體系去除Cr（Ⅵ）的影響因素

2.4.1 Cr（Ⅵ）初始質量濃度

在反應溫度為30 ℃、體系pH為7.0的條件下，Cr（Ⅵ）初始質量濃度對Cr（Ⅵ）去除率的影響見圖7。由圖7可見：隨著Cr（Ⅵ）初始質量濃度的升高，Cr（Ⅵ）去除率顯著降低。這是因為：Cr（Ⅵ）初始質量濃度低于10 mg/L時，Nano-FeS過量，Cr（Ⅵ）去除率接近100%，隨著Cr（Ⅵ）初始質量濃度升高，化學反應趨于平衡，Cr（Ⅵ）去除率開始下降；另一方面，在Cr（Ⅵ）初始質量濃度較高的條件下，SRB會發生蛋白質變性，造成微生物中毒，使Cr（Ⅵ）去除率降低。

圖7 Cr（Ⅵ）初始質量濃度對Cr（Ⅵ）去除率的影響

2.4.2 反應溫度

在Cr（Ⅵ）初始質量濃度為20 mg/L、體系pH為7.0的條件下，反應溫度對Cr（Ⅵ）去除率的影響見圖8。由圖8可見：隨著反應溫度的升高，Cr（Ⅵ）去除率先升高后降低；當反應溫度為25 ℃時，Cr（Ⅵ）去除率為47%；當反應溫度為35 ℃時，Cr（Ⅵ）去除率增加至77%。這是因為溫度升高，酶活性增加，活化分子數增加，反應速率加快，因而Cr（Ⅵ）去除率升高。當反應溫度升至40 ℃時，Cr（Ⅵ）去除率相較35 ℃有所下降，這是因為大多數SRB的最適生長溫度為30~35 ℃，溫度過高，SRB的生長受到抑制［18］。本實驗選擇反應溫度為35 ℃較適宜。

圖8 反應溫度對Cr（Ⅵ）去除率的影響

2.4.3 體系pH

在Cr（Ⅵ）初始質量濃度為20 mg/L、反應溫度為35 ℃的條件下，體系pH對Cr（Ⅵ）去除率的影響見圖9。由圖9可見：當體系pH為5.0時，24 h內Cr（Ⅵ）去除率達93%；隨著體系pH升高，Cr（Ⅵ）去除率逐漸下降。這是因為：一方面，FeS的溶解度隨pH的升高而下降，高pH條件下，FeS溶解產生的還原性Fe2+和S2-均急劇減少，Cr（Ⅵ）還原速率減慢；另一方面，溶液pH大于FeS的等電點（≈7.5）時，FeS與Cr（Ⅵ）之間存在靜電斥力［19］，不利于Cr（Ⅵ）的吸附，因而Cr（Ⅵ）的去除率下降。

圖9 體系pH對Cr（Ⅵ）去除率的影響

3 結論

a）在Cr（Ⅵ）初始質量濃度為10 mg/L的條件下，Nano-FeS@SRB體系中Cr（Ⅵ）的去除速率遠高于SRB體系，說明Nano-FeS@SRB具有較高的Cr（Ⅵ）還原能力，Nano-FeS@SRB體系中Cr（Ⅵ）的還原是微生物介導的過程。經Nano-FeS@SRB體系處理后，Cr（Ⅵ）被轉化為低毒的Cr（OH）3和Cr2O3，極大程度地降低了Cr（Ⅵ）對生物和環境的危害。

b）電化學實驗表明，Nano-FeS的加入增強了SRB的胞外電子傳遞，可以作為電子穿梭體將細胞代謝產生的電子傳遞給Cr（Ⅵ），實現Cr（Ⅵ）到Cr（Ⅲ）的還原。

c）在Cr（Ⅵ）初始質量濃度為20 mg/L、反應溫度為35 ℃、體系pH為5.0的條件下，Cr（Ⅵ）去除率為93%。