尿液代謝組學(xué)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的應(yīng)用研究進(jìn)展

武丹彤，常亞娟，王瑤，艾民，匡海學(xué)

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種病因尚未完全闡明的慢性自身免疫性結(jié)締組織疾病。在全球范圍內(nèi)，SLE發(fā)病率為每年0.3/10萬人～23.2/10萬人，其發(fā)病多見于育齡期女性，女性患病率明顯高于男性，男女患病比例約為1∶9[1-2]。SLE的確切病因尚不明確且發(fā)病機(jī)制涉及多個因素，包括遺傳易感性、環(huán)境因素和雌激素等[3-4]。其特征為存在多種自身抗體和免疫復(fù)合物積累，伴有補(bǔ)體系統(tǒng)的參與及慢性炎癥[5-6]。SLE具有廣泛的臨床表現(xiàn)，可累及全身多個器官，包括大腦、心臟、腎臟和皮膚等[7-8]。由于SLE的異質(zhì)性，目前臨床缺乏敏感性和特異性良好的檢驗(yàn)標(biāo)志物，隨著相關(guān)檢驗(yàn)技術(shù)手段的進(jìn)步，近年開展了有關(guān)SLE患者臨床診斷技術(shù)的研究[9]。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后發(fā)展起來的一門全新學(xué)科，具有整體、動態(tài)、綜合的特點(diǎn)，是一種基于整體性分析的技術(shù)[10]。近年隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，人們對包括SLE在內(nèi)的復(fù)雜疾病的病因和發(fā)病機(jī)制有了更多的了解，代謝組學(xué)在SLE領(lǐng)域的研究也越來越受到關(guān)注[11-12]。由于尿液標(biāo)本獲取方便且無創(chuàng)傷性，代謝物豐富并能夠反映體內(nèi)整體代謝水平，今后隨著檢測設(shè)備和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尿液代謝物的定性和定量檢測將成為醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用的重要手段[13]。現(xiàn)就尿液代謝組學(xué)在SLE臨床診斷和藥物評價(jià)中的應(yīng)用進(jìn)展予以綜述。

1 SLE臨床診斷現(xiàn)狀

2019年，美國風(fēng)濕病學(xué)會和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟聯(lián)合發(fā)表了SLE最新分類標(biāo)準(zhǔn)，其診斷的靈敏度為96.1%，特異度為93.4%[14]。該分類標(biāo)準(zhǔn)將抗核抗體滴度≥1∶80作為SLE入圍指標(biāo)，之后按照7種臨床表現(xiàn)和3個免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)評分，總分超過10分考慮診斷為SLE[15]。

目前，對于SLE尚無準(zhǔn)確的早期診斷和疾病監(jiān)測指標(biāo),醫(yī)師常根據(jù)患者就診的臨床癥狀(如臉部蝴蝶斑疹、關(guān)節(jié)腫脹、發(fā)熱、疲勞)和常規(guī)檢驗(yàn)指標(biāo)(抗核抗體、抗雙鏈DNA抗體、抗Sm抗體、補(bǔ)體C3、C4等)進(jìn)行診斷，但這些指標(biāo)的敏感性和特異性有限[16-17]。狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是一種嚴(yán)重的SLE累及腎臟的并發(fā)癥，據(jù)統(tǒng)計(jì)SLE患者中約40%會發(fā)展為LN，而在這些患者中約10%會發(fā)展為終末期腎病。當(dāng)前診斷和監(jiān)測LN依賴于腎活檢，但費(fèi)用較高、操作復(fù)雜，且樣本可能不能代表整個腎臟的狀況[18]。因此，早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療可能對SLE及其并發(fā)癥的發(fā)生率和病死率產(chǎn)生重大影響，但是當(dāng)前的診斷技術(shù)尚無法滿足臨床需求，臨床急需操作簡便、準(zhǔn)確率和靈敏度高的診斷方法[19-20]。

2 代謝組學(xué)技術(shù)概述

代謝組學(xué)這一概念于1999年首次提出，主要是指運(yùn)用現(xiàn)代檢測技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析方法對生物體內(nèi)組織、細(xì)胞或體液中分子量<1 500的內(nèi)源性小分子代謝物進(jìn)行定性或定量檢測，獲得機(jī)體在病理生理刺激或環(huán)境因素變化等不同影響下的差異代謝標(biāo)志物[21-22]。

2.1代謝組學(xué)的分類和研究過程 根據(jù)研究目的，代謝組學(xué)可分為非靶向代謝組學(xué)和靶向代謝組學(xué)。其中，非靶向代謝組學(xué)可同時(shí)檢測樣品中所有可檢測的代謝物，分析每個樣品中已知和未知代謝物，檢測后產(chǎn)生大量復(fù)雜的數(shù)據(jù)，需要結(jié)合高性能的生物信息學(xué)工具進(jìn)行分析。但這些化合物中大部分的結(jié)構(gòu)仍然未知，因此化合物鑒定是非靶向代謝組學(xué)的一大障礙，目前該項(xiàng)技術(shù)主要應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)潛在的差異代謝標(biāo)志物[23]。靶向代謝組學(xué)使用標(biāo)準(zhǔn)品定量檢測樣品中特定的代謝物，檢測結(jié)果具有良好的精確度和準(zhǔn)確度，并與已知參考范圍進(jìn)行比較，分析差異代謝物變化的潛在生物學(xué)機(jī)制[24]。

代謝組學(xué)的研究過程包括前期的樣品采集和制備、中期的代謝物檢測和數(shù)據(jù)采集，以及后期的數(shù)據(jù)分析等環(huán)節(jié)[25]。首先收集血液、尿液、糞便等生物樣品，將標(biāo)本進(jìn)行離心或均質(zhì)化處理后通過核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)或質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)技術(shù)檢測樣品中所有代謝物的種類和含量，從中收集原始光譜數(shù)據(jù)并通過多元統(tǒng)計(jì)分析以及各種聚類和分類技術(shù)對大量原始數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，通過化合物數(shù)據(jù)庫與標(biāo)準(zhǔn)化合物進(jìn)行比對，準(zhǔn)確識別代謝物。然后以散點(diǎn)圖或氣泡圖等形式展示所得數(shù)據(jù)。代謝物是生物體內(nèi)各種酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物或終產(chǎn)物，代謝組學(xué)對體內(nèi)代謝物進(jìn)行全面系統(tǒng)的分析，闡述生物體在各種因素刺激下的代謝變化[26]。

2.2代謝組學(xué)的檢測平臺 目前，代謝組學(xué)主要運(yùn)用液相色譜(liquid chromatography，LC)-MS聯(lián)用、氣相色譜(gas chromatography，GC)-MS聯(lián)用和NMR等高通量、高分辨率和高靈敏度的代謝分析平臺[27]。鑒于每個檢測平臺各自的優(yōu)缺點(diǎn)，它們已單獨(dú)或組合應(yīng)用于非靶向和靶向代謝組學(xué)研究，檢測氨基酸、脂質(zhì)、碳水化合物等物質(zhì)[28]。MS法利用不同代謝物離子化后的化合物通過色譜柱的時(shí)間不同進(jìn)行分離，根據(jù)不同化合物產(chǎn)生不同的峰值強(qiáng)度確定代謝物的分子量。MS法中LC-MS技術(shù)具有良好的靈敏度和廣泛的代謝物檢測范圍，其利用極性、離子質(zhì)荷比和分子大小的差異使代謝物分離，但穩(wěn)定性較差且化合物鑒定難度大，該技術(shù)可以對大量代謝物進(jìn)行分離，提供較全面的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)[29]。GC-MS技術(shù)性能穩(wěn)定且重現(xiàn)性好，主要用于分離低分子量揮發(fā)性化合物，但樣品制備操作煩瑣，且這種技術(shù)分析的代謝物必須熱穩(wěn)定性良好且呈非極性。目前通過衍生化增加分析物的揮發(fā)性，但操作耗時(shí)較長且生成的產(chǎn)物穩(wěn)定性較差，測量結(jié)果可能無法完全反映代謝物的原始濃度。由于揮發(fā)性和極性的限制，GC-MS識別代謝物的數(shù)量相對較少，目前GC-MS主要應(yīng)用于靶向代謝組學(xué)[30]。而NMR技術(shù)樣品制備容易，結(jié)果重現(xiàn)性高，但靈敏度較低且受pH值影響，考慮到尿液標(biāo)本可能存在低豐度代謝物且尿液pH值變化較大，因此NMR不是尿液代謝組學(xué)生物標(biāo)志物的理想分析技術(shù)[31]。目前，LC-MS是應(yīng)用最廣泛的尿液代謝組學(xué)分析技術(shù)，但在靈敏度、分辨率、檢測限等方面仍需要不斷改進(jìn)，且較GS-MS缺乏成熟的商業(yè)化代謝物數(shù)據(jù)庫。

3 尿液代謝組學(xué)與SLE

尿液標(biāo)本獲取方便、無創(chuàng)傷性、經(jīng)濟(jì)有效，身體大部分最終代謝物均集中在尿液。尿液代謝組學(xué)可定性或定量分析SLE患者內(nèi)源性小分子代謝物，衡量機(jī)體特定疾病或治療干預(yù)的細(xì)微代謝差異。經(jīng)大規(guī)模臨床研究驗(yàn)證后，尿液代謝物可作為疾病診斷和病情評估的潛在生物標(biāo)志物。近年來，尿代謝組學(xué)已成為發(fā)現(xiàn)非侵入性生物標(biāo)志物的重要研究手段[32-33]。有學(xué)者已開展多項(xiàng)利用GC-MS、LC-MS和NMR等分析手段對SLE患者血液、尿液標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)代謝組學(xué)分析的研究[34-35]。研究結(jié)果表明，尿液代謝組學(xué)在SLE鑒別診斷、藥物有效性評價(jià)等方面具有良好的效果，是一種在SLE及其并發(fā)癥早期診斷、早期治療和藥物研發(fā)方面具有廣闊應(yīng)用前景的新型檢測技術(shù)。

3.1尿液代謝組學(xué)在SLE診斷中的應(yīng)用 Alonso等[36]使用NMR技術(shù)對1 210例包括SLE在內(nèi)的6種免疫介導(dǎo)的炎性疾病患者和100例對照者尿液標(biāo)本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些患者(尤其是臨床癥狀相似的患者)表現(xiàn)出相似的尿液代謝變化；且與對照者相比，炎性疾病患者尿液中涉及三羧酸循環(huán)、苯丙氨酸代謝和甘氨酸-絲氨酸代謝途徑的代謝物含量增加，提示尿液代謝標(biāo)志物在免疫介導(dǎo)的炎性疾病方面具有重要作用。Yan等[37]通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測28例SLE患者和47名健康受試者尿液代謝生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，在包含氨基酸、核苷酸、脂肪酸、尿酸鹽等在內(nèi)的70種代謝物中，SLE患者尿液中23種代謝物水平顯著升高，代謝途徑涉及纈氨酸、亮氨酸以及異亮氨酸的降解和生物合成、嘧啶代謝、嘌呤代謝、三羧酸循環(huán)、肌醇磷酸代謝等，提示SLE會干擾能量代謝、核苷酸代謝、氧化應(yīng)激和腸道微生物代謝。當(dāng)前LN的診斷是基于血清自身抗體和侵入性腎活檢檢測，有學(xué)者使用NMR技術(shù)比較14例LN患者、10例SLE患者和11名健康對照者的尿液代謝情況，通過主成分分析法和正交偏最小二乘判別分析法篩選差異代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-丙氨酸、2，2-二甲基水楊酸和3，4-二羥基苯基乙醛對LN的診斷具有很高的敏感性和特異性，是值得未來深入探究的3個候選標(biāo)志物[38]。另一項(xiàng)早期研究使用NMR技術(shù)對LN患者和局灶節(jié)段性腎小球硬化患者尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)與非膜性LN(Ⅲ/Ⅳ級)患者尿液代謝物相比，膜性LN(Ⅴ級)患者尿液代謝物中的檸檬酸水平下降，但牛磺酸水平升高，而檸檬酸和牛磺酸是衡量腎小管細(xì)胞功能的指標(biāo)[39]。未來這些尿液代謝物在大規(guī)模臨床研究中得到證實(shí)后，將有望作為潛在的診斷標(biāo)志物，以幫助臨床區(qū)分不同類型的LN患者。

3.2尿液代謝組學(xué)在SLE藥物治療評價(jià)中的應(yīng)用 為了研究中藥復(fù)方解毒祛瘀滋陰方對SLE治療效果及分析代謝物特征，有學(xué)者應(yīng)用GC-MS法對使用解毒祛瘀滋陰方的SLE模型小鼠進(jìn)行尿液代謝組學(xué)檢測。結(jié)果表明，解毒祛瘀滋陰方治療后的SLE模型小鼠的尿代謝物水平與正常對照小鼠接近[40]，且治療組SLE模型小鼠尿液中的檸檬酸、蘋果酸等11種代謝物與能量代謝和氨基酸代謝途徑有關(guān)，這些結(jié)果可為進(jìn)一步探索中藥治療SLE的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。Ganguly等[41]使用NMR技術(shù)對18例經(jīng)腎活檢確診的LN患者和18名健康對照者進(jìn)行尿液代謝組學(xué)檢測，以評估環(huán)磷酰胺治療前后尿液檸檬酸和乙酸的排泄水平。結(jié)果顯示，與健康對照者相比，LN患者尿液中的檸檬酸/肌酐比值顯著降低，乙酸鹽/肌酐比值升高；環(huán)磷酰胺治療6個月后，檸檬酸/肌酐比值顯著升高，而乙酸鹽/肌酐比值無明顯變化。且在LN患者尿液中檸檬酸水平的變化與SLE疾病活動度評分呈正相關(guān)，該研究表明尿液代謝物檸檬酸有望作為LN藥物治療評價(jià)的潛在標(biāo)志物。

3.3尿液代謝組學(xué)在SLE應(yīng)用中的局限性 目前，尿液代謝組學(xué)在SLE疾病診斷、機(jī)制探討、臨床用藥等方面仍處于起步階段。雖然任何體液樣本均可以用作臨床生物標(biāo)志物，但尿液標(biāo)本含量豐富并可以通過非侵入性方式獲得，對于嬰幼兒、老年人等不能輕易提供足量血液樣本的患者是一個理想的選擇[13]。保持尿液中代謝物的穩(wěn)定性對于保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠和后續(xù)分析至關(guān)重要，然而尿液代謝物很容易受溫度、儲存時(shí)間和細(xì)菌污染等因素的影響，因此尿液樣本收集和制備過程中需盡量保持原始樣本的代謝物狀態(tài)，并減少尿液代謝物損失和降解[42-43]。目前，關(guān)于尿液標(biāo)本采集以及樣品制備等環(huán)節(jié)尿液代謝物穩(wěn)定性的研究較少，尿液代謝組學(xué)標(biāo)本采集、樣品制備以及儲存尿液樣本的條件等尚缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)操作程序[44]。此外，雖然近年來代謝組學(xué)相關(guān)檢測設(shè)備和生物信息學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，但是目前每種代謝組學(xué)檢測平臺均不能對樣品中所有代謝物進(jìn)行全面的定性和定量檢測，且不同組學(xué)(基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等)的數(shù)據(jù)沒有很好的整合，從一種組學(xué)方法獲得的測量結(jié)果很難與通過其他組學(xué)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)。整合多組學(xué)數(shù)據(jù)集進(jìn)行整體綜合分析，進(jìn)而揭示SLE發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜機(jī)制，還需今后不斷改進(jìn)和發(fā)展基于MS的數(shù)據(jù)處理技術(shù)和生物信息學(xué)分析軟件[45]。

4 小 結(jié)

SLE是一種復(fù)雜的多系統(tǒng)自身免疫性疾病，早期臨床表現(xiàn)不明顯，診斷較為困難，當(dāng)前臨床檢測手段雖然具有一定的敏感性和特異性，但通常會導(dǎo)致診斷延遲或漏診，因此急需尋找更好的用于SLE的診斷、監(jiān)測并闡明SLE發(fā)病機(jī)制的生物標(biāo)志物。代謝組學(xué)研究可以在代謝水平發(fā)現(xiàn)疾病的標(biāo)志物，輔助疾病的早期診斷，為臨床診療提供參考。隨著代謝組學(xué)相關(guān)檢測技術(shù)不斷發(fā)展，尿液代謝組學(xué)已被應(yīng)用于糖尿病、腫瘤等疾病領(lǐng)域并取得良好成果[46-47]。

與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)相比，代謝組學(xué)是一門新興學(xué)科。代謝物可作為許多疾病的檢測生物標(biāo)志物，它們是體內(nèi)合成代謝和分解代謝途徑的最終產(chǎn)物，提供個體生理狀態(tài)的準(zhǔn)確表征[48]。目前代謝組學(xué)研究結(jié)果臨床轉(zhuǎn)化尚處于早期階段，此類技術(shù)的臨床廣泛應(yīng)用仍需進(jìn)一步驗(yàn)證[49]。未來隨著尿液標(biāo)本規(guī)范性處理和檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)一步完善，尿液代謝組學(xué)在SLE發(fā)病機(jī)制研究、疾病預(yù)測、診斷分期和個性化治療等方面的應(yīng)用將具有廣闊前景。