虎耳草總黃酮含量測定及其抗氧化性

文培華，顏怡冰，王文君，張巖，向燦輝

遵義醫(yī)科大學珠海校區(qū)生物工程系（珠海 519041）

虎耳草（Saxifraga stoloniferaCurt）為虎耳草科多年生草本植物，全草入藥，性寒、微苦、辛，有小毒，歸肺、脾、大腸經，具有祛風清熱、涼血解毒的功效。民間主要用于治療風疹、濕疹、外傷出血、丹毒、痔疾、中耳炎、咳嗽等疾病[1-3]。虎耳草在我國不僅種類豐富（203種）[4]，且分布廣泛，遍布華東、中南、西南南部及陜西等地，目前虎耳草的研究主要集中在虎耳草的栽培種植、植物基因組分析及其化學成分鑒定，虎耳草已鑒定出黃酮類、萜類、酚酸類及異香豆精類化合物等20余種，不同產地的虎耳草在成分種類、數量、含量上有共通性，也存在差異性，槲皮素、巖白菜素為虎耳草的代表性有效成分[5-7]。現代研究表明虎耳草提取物槲皮素、巖白菜素具有抗腫瘤作用[5-8]，也有研究表明虎耳草提取物具有抗菌、護肝和抗氧化作用，對羥基自由基表現出較高的清除能力[9-10]，但只是對粗提物的抗氧化能力進行了分析。因此，此次試驗將深入研究虎耳草不同極性部位的抗氧化作用及其與黃酮含量的相關性，深入研究虎耳草活性部位及活性成分，為綜合利用和深度開發(fā)藥用植物虎耳草提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

虎耳草：購自安徽，經遵義醫(yī)科大學陳陽教授鑒定。

對照品：DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）、ABTS（2,2’-聯氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺）二氨鹽）、蘆丁、VC，購自合肥博美生物公司；其他試劑均為國產分析純。

UV-2600紫外-可見分光光度計（日本島津）；超聲波清洗儀（上海同天生物技術股份有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀（Hei-VAP，德國Heidolph公司）

1.2 試驗步驟

1.2.1 制備虎耳草不同極性部位樣品

虎耳草全草，清除雜草，干燥，剪成碎段，粉碎至粗粉，過0.250 mm篩，稱取500 g粗粉，以料液比1∶3（g/mL）加入80%的乙醇進行超聲提取1 h，置夜，抽濾，濾渣再以料液比1∶1（g/mL）加入80%乙醇，超聲1 h，抽濾，濾渣再以料液比1∶1（g/mL）提取1次，抽濾。合并3次濾液，減壓旋蒸至無溶劑滴出，得到虎耳草黏稠浸膏，編號為樣品1。

留取少量樣品1，其余浸膏以料液比1∶5（g/mL）加入蒸餾水得到虎耳草浸膏溶液，然后向溶液中加入1∶1（g/mL）體積比的石油醚溶劑，充分混合萃取，分出石油醚層，再重復萃取兩次，合并萃取液，減壓旋蒸，得到石油醚萃取物浸膏，稱為樣品2；繼續(xù)向水溶液中分別加入1∶1（g/mL）體積比的乙酸乙酯、正丁醇溶劑，進行同樣的操作，得到乙酸乙酯萃取物浸膏和正丁醇萃取物浸膏，稱為樣品3和樣品4；剩余的水溶液減壓旋蒸得到水提物浸膏，稱為樣品5。

1.2.2 DPPH抗氧化性測定

1.2.2.1 試劑制備

DPPH試劑：準確稱取12.50 mg的DPPH標準品，用無水乙醇溶解定容至250.00 mL，得到質量濃度為0.050 mg/mL的DPPH標準溶液，使用前進行適當稀釋，使吸光度為0.70±0.05，作為使用液。

1.2.2.2 樣品溶液制備

稱取一定量的對照品VC、樣品1～4浸膏，用無水乙醇溶解定容。樣品5浸膏用DMSO溶解定容。然后每個樣品均制備成5個質量濃度梯度的樣品溶液，見表1。

表1 虎耳草樣品和VC樣品溶液制備

1.2.2.3 抗氧化性測定[11]

準確移取3.90 mL DPPH使用液，分別加入100 μL表1中各樣品溶液，顯色30 min，無水乙醇為空白對照，在517 nm波長下測定各樣液的吸光度A。同時，以100 μL無水乙醇代替樣品在相同的條件下進行測定，吸光度記為A0。平行測定3次，繪制清除率曲線，按式（1）計算半抑制率IC50值。

式中：A0為DPPH的初始吸光度；A為加入樣品溶液后DPPH的吸光度。

1.2.3 ABTS+抗氧化性測定

1.2.3.1 試劑制備

精密稱取96.33 mg的ABTS藥品，即（Mr=548.68），同時稱取16.56 mg的K2S2O8（過硫酸鉀Mr=270.32）固體顆粒，分別用超純水溶解定容至25.00 mL，配制成7.00 mmol/L的ABTS水溶液和2.45 mmol/L的K2S2O8水溶液，按體積比1∶1（mL/mL）混合，在室溫、避光的環(huán)境下混合12 h以上，即得濃度為3.5 mmol/L的ABTS+工作液。試驗前用無水乙醇稀釋約50倍，得到ABTS+使用液，吸光度為0.70±0.05。

1.2.3.2 樣品溶液制備

稱取一定量的對照品VC、樣品1～4浸膏，用無水乙醇溶解定容。樣品5浸膏用DMSO溶解定容。然后每個樣品均制備成5個質量濃度梯度的樣品溶液，見表2。1.2.3.3 抗氧化性測定[11]

吸取100 μL表2中各樣品溶液，再向其中加入3.00 mL的ABTS+使用液，振蕩，室溫條件下避光反應30 min，在750 nm波長下測定吸光度A。同時，以100 μL的甲醇代替樣品溶液，在相同條件下進行測定，吸光度為A0，繪制清除率曲線，按式（2）計算IC50值。

表2 虎耳草樣品和VC樣品溶液制備

式中：A0為ABTS+的初始吸光度，A為加入樣品溶液后ABTS+的吸光度。

1.2.4 虎耳草樣品中總黃酮含量測定

1.2.4.1 溶液制備

稱取30.0 mg的蘆丁標準品，用無水乙醇溶解定容至100.00 mL，質量濃度為0.30 mg/mL，然后進行梯度稀釋，制備質量濃度分別為30，70，110，150和190 μg/mL的蘆丁標準溶液。根據標準曲線的線性范圍，配制合適濃度的各樣品溶液，備用。

1.2.4.2 含量測定-硝酸鋁顯色法[11]

移取上述蘆丁標準溶液各800 μL，分別加入到2.00 mL 1～5號容量瓶中，向0號容量瓶中加入800 μL溶劑，再各加40 μL 5% NaNO2溶液搖勻，放置6 min，加入40 μL 10% Al(NO3)3溶液搖勻，放置6 min，加320 μL 4% NaOH，再用蒸餾水定容，搖勻，放置10 min，于510 nm測定吸光度，繪制標準曲線。樣品溶液在相同的條件下進行測定吸光度，根據標準曲線，計算樣品中總黃酮的含量。

1.2.4.3 加標回收率測定

加入樣品中黃酮含量80%，100%和120%的標準品蘆丁，測定加標回收率。

2 結果與分析

2.1 虎耳草不同極性部位浸膏得率

500 g虎耳草粗粉經過80%乙醇浸泡、超聲提取三次，減壓旋蒸得到20.90 g浸膏，得率為4.18%，所得浸膏依次經過石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取后得到不同極性部位浸膏，分別為7.35，1.46，5.99和4.91 g，結果見表3。

表3 不同極性部位浸膏得率

2.2 虎耳草對DPPH抗氧化測定結果

從圖1可看出：在相同的濃度下，樣品3（乙酸乙酯萃取物）具有最高的清除DPPH自由基能力，而在相同的清除率時，其需要最小的濃度。五個樣品清除DPPH自由基的能力均隨濃度的增大而增強，具有劑效依賴性，且呈現線性關系，線性相關系數均在0.99以上，半抑制率IC50值分別為39.5，35.0，12.6，20.4和116 μg/mL，即對DPPH自由基的清除能力：樣品3＞樣品4＞樣品2＞樣品1＞樣品5，但均弱于對照品VC（IC50=3.59 μg/mL），樣品3清除DPPH自由基的能力約為VC的1/4，見表4。

表4 DPPH自由基清除曲線線性分析數據表

圖1 虎耳草清除DPPH自由基的線性關系圖

IC50是評價抗氧化能力強弱的常用指標，其值越小表示抗氧化能力越強。從圖2可直觀看出樣品3的抗氧化能力最強，樣品5的抗氧化能力最弱。樣品3的抗氧化能力較接近對照品VC，其質量濃度在體系中達到22.5 μg/mL時，清除率高達84%，說明樣品3具有較好的抗氧化性。

圖2 虎耳草樣品對DPPH自由基抗氧化能力

2.3 ABTS+抗氧化測定結果

從圖3和表5可以看出，五個樣品和VC清除ABTS+自由基的能力均隨濃度的增大而增大，具有劑效依賴性，且表現很好的線性關系，線性相關系數均大于0.99，IC50值分別為19.9，18.8，4.90，13.9，53.4和3.35 μg/mL，其中樣品3清除ABTS+自由基的能力顯著優(yōu)于其他四個樣品，與VC很接近（見圖4）。當樣品3的濃度達到8.06 μg/mL時，清除率達到78%，表明樣品3具有很好的抗氧化活性。

圖3 虎耳草清除ABTS+自由基的線性關系圖

圖4 虎耳草樣品對ABTS+自由基的抗氧化能力

表5 ABTS+自由基清除曲線線性分析數據表

2.4 虎耳草不同極性部位黃酮含量

2.4.1 標準曲線測定

以蘆丁作為對照品測定標準曲線，在30～160 μg/mL的質量濃度范圍內，蘆丁質量濃度與吸光度具有良好的線性關系（見圖5），線性方程為y=4.297 7x+0.01，線性相關系數為0.998 7（見表6），滿足定量分析的要求，可用于總黃酮含量測定。

表6 蘆丁標準曲線線性關系數據

圖5 蘆丁標準曲線

2.4.2 黃酮含量測定

虎耳草不同極性部位的五個樣品均進行總黃酮含量分析，每個樣品重復測定3次，結果見表7。總黃酮含量：樣品3＞樣品2＞樣品4＞樣品1＞樣品5，其中樣品3的總黃酮含量為38.4%，說明使用不用極性溶劑萃取實現了對活性成分的有效富集。計算公式為：總黃酮含量=×100%

表7 虎耳草五個樣品的總黃酮含量測定數據（n=3）

2.4.3 加標回收率

加入樣品中總黃酮質量的80%，100%和120%的標準品蘆丁，測得回收率分別為99.9%，101.7%和96.0%，SRSD為2.94%。

2.4.4 重復性

每個樣品均進行3次平行測定總黃酮含量，SRSD分別為1.33%，0.74%，1.51%，0.66%和0.43%，方法重復性很好。

2.5 抗氧化性與黃酮含量相關性分析

從DPPH和ABTS+兩個抗氧化試驗的測定結果可以發(fā)現，樣品黃酮含量高則抗氧化性也高，抗氧化性和黃酮含量具有正相關性，相關性系數在0.65以上（表8）。樣品3的黃酮含量最高，其表現出的DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清楚能力也最強，即抗氧化活性最強，很接近于對照品VC。

表8 抗氧化性與黃酮含量相關性數據表

3 討論

黃酮類物質廣泛存在于自然界，表現出很多生物活性，作為天然抗氧化劑開發(fā)是研究熱點之一。此次試驗深入分析了虎耳草不同極性部位的總黃酮含量及其抗氧化性，結果發(fā)現不僅每個樣品的抗氧化性具有劑效依賴關系，而且不同樣品的抗氧化性和黃酮含量之間具有較好的線性正相關關系，表明黃酮類物質可能是虎耳草具有抗氧化性的物質基礎。乙酸乙酯萃取物的黃酮含量最高，其表現出的抗氧化能力也最佳，和對照品VC很接近。

在抗氧化性分析中，水萃取物在兩個模型中的IC50值都很大，盡管隨著質量濃度的增大也表現出很好的線性關系，但和黃酮含量的相關性缺失，初步分析可能是因于水萃取物的成分比其他樣品更復雜，其他樣品都可以很好溶于乙醇中，但水提物不能。因此，在做抗氧化性與黃酮含量相關性分析時，沒有涉及水萃取物。

4 結論

使用不同極性溶劑可以實現對虎耳草活性成分的有效富集，乙酸乙酯萃取物（樣品3）總黃酮含量最高，達到38.4%，表現出顯著的DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力，IC50值分別為12.6和4.90 μg/mL，接近于對照品VC，表明樣品3具有良好的抗氧化性。抗氧化性研究結果同時表明，虎耳草不同極性部位的抗氧化性和黃酮含量存在正相關性，黃酮含量越高，抗氧化能力也越強，說明黃酮可能是虎耳草表現出抗氧化性的有效成分。可據此進行中草藥虎耳草作為天然抗氧化劑的深入開發(fā)和綜合應用。