藍光殺菌技術(shù)在散裝肉制品銷售環(huán)節(jié)的研究與應(yīng)用

厲建軍，張建梅，孫曉紅，侯世松

煙臺喜旺肉類食品有限公司（煙臺 264000）

散裝肉制品因其口感勁脆、口味清香、細嫩爽滑、滋味優(yōu)美、風(fēng)味獨特、食用方便，深受廣大消費者喜歡。肉品營養(yǎng)豐富，但是由于散裝肉制品在銷售環(huán)節(jié)多為裸露銷售，極易受到二次污染，從而引發(fā)食品安全問題。

傳統(tǒng)熱殺菌技術(shù)，能有效滅活有害微生物，確保食品安全性，但高熱會引發(fā)許多不良反應(yīng)，導(dǎo)致食品品質(zhì)劣變，例如肉品營養(yǎng)、感官品質(zhì)下降等[1]。藍光殺菌是一種非熱殺菌技術(shù)，可以在不改變或最小限度影響肉及肉制品感官品質(zhì)和營養(yǎng)特性的前提下，有效抑制腐敗微生物的生長和繁殖，延長貨架期。藍光殺菌具有多方面優(yōu)點：首先它不需要添加外源光敏劑；其次可以更好地殺滅或減少細菌生物膜內(nèi)的細菌，到目前為止，尚無文獻報道細菌對其產(chǎn)生了抵抗性；第三藍光安全性高，光束能夠局限在細菌感染的區(qū)域，不會影響其他的非感染部位；第四光照輻射強度可被較好地調(diào)整和監(jiān)控，相對抗菌藥物而言安全性更高[2]。目前，藍光已經(jīng)被臨床廣泛用于治療痤瘡，并取得了很好的療效[3]。

國內(nèi)外對藍光的研究大部分集中在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在食品領(lǐng)域的研究很少，試驗以低溫肉制品為研究對象，明確藍光殺菌的關(guān)鍵參數(shù)，及藍光殺菌在低溫肉制品中的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉，煙臺喜旺公司；單增李斯特菌ATCC 19115，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）、營養(yǎng)瓊脂、平板計數(shù)瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；三氯乙酸、鹽酸、甲基紅、亞甲基藍等，國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PL-2001-L電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；HPX-9162MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；K9840定氮儀（山東海能科學(xué)儀器有限公司）；TU-1810D紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；WGZ-XT細菌濁度儀（杭州奇威儀器有限公司）；PHS-3C pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種復(fù)蘇

復(fù)蘇菌種前應(yīng)準(zhǔn)備適合該菌種生長的培養(yǎng)基和培養(yǎng)設(shè)備，所有操作均應(yīng)在符合生物安全保護及無菌的條件下進行。復(fù)蘇前準(zhǔn)備：將微量移液器、無菌槍頭、胰蛋白胨大豆酵母浸膏瓊脂（TSA-YE）等試驗用品放入生物安全柜，常規(guī)紫外線滅菌15 min，實驗者戴好口罩、帽子，然后使用75%酒精的脫脂棉球?qū)ι锇踩癫僮髋_進行再次消毒，雙手戴好實驗專用丁腈手套，并用75%酒精消毒。復(fù)蘇時首先拉開鋁蓋，用浸過75%酒精的脫脂棉球擦凈丁基膠塞及西林瓶，然后吸取液體培養(yǎng)基0.5～1 mL，滴入西林瓶內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，用微量移液器取10～100 μL菌體懸浮液接種于TSA-YE平板培養(yǎng)基中，將接種后的培養(yǎng)基平板放入36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h即可形成菌落，觀察菌落的生長情況。菌落形成后，將培養(yǎng)基平板放入2～8 ℃冰箱中保存以備用[4]。

1.3.2 關(guān)鍵參數(shù)的確定

保存有單增李斯特菌落的TSA-YE培養(yǎng)基平板取出，用酒精燈火焰對接種環(huán)進行滅菌后，使用無菌接種環(huán)挑取單個菌落加入裝有10 mL PBS的無菌離心管中，混合均勻制成菌懸液。用細菌濁度儀測量細菌濁度為0.1 MCF時，此時相當(dāng)于菌液濃度為1×108CFU/mL，使用PBS將單增李斯特菌液進行稀釋，然后將10ul 濃度為 1×106CFU/mL的單增李斯特菌菌液用無菌接種環(huán)均勻涂布于TSA-YE培養(yǎng)基中。

移去涂布后的TSA-YE平板的蓋子，用波長為450～ 470 nm的藍光照射平板4 h，藍光功率密度為 80 mW/cm2，5個平板的光源距離分別設(shè)20，25，30，35和40 cm，為了防止光照射過程中產(chǎn)熱而影響試驗結(jié)果，需將平板置于超凈臺中并予以通風(fēng)。光照結(jié)束后，所有平板都放入36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后取出平板，計算各個平板內(nèi)的菌落數(shù)。確定最佳光源距離。

將涂布后的TSA-YE平板的蓋子打開，光源距離設(shè)為30 cm，分別給予0，0.5，1，2，3和4 h的藍光照射，其余操作同上。確定最佳光照時間。

1.3.3 驗證試驗

在0～10 ℃銷售冷柜上方日光燈旁固定藍光燈，牛肉正常陳列，每天取樣進行檢測，檢測項目為感官、菌落總數(shù)、pH、TBARS、TVB-N。同時進行對照試驗，試驗在相同的條件下重復(fù)3次。

1.3.4 指標(biāo)測定

1.3.4.1 感官品質(zhì)評定

依據(jù)GB 2726《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品》，由10名具有食品專業(yè)背景的技術(shù)研發(fā)及工藝人員組成感官評定小組，從組織結(jié)構(gòu)、質(zhì)地口感、外觀色澤、風(fēng)味滋味四個方面對上述產(chǎn)品進行逐一評價，并匯總票數(shù)[5]。對感官分值進行統(tǒng)計分析，根據(jù)分析結(jié)果對產(chǎn)品進行評價。具體評分標(biāo)準(zhǔn)與測試方法如表1所示。

表1 產(chǎn)品感官評分項目與評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.4.2 菌落總數(shù)的測定

參照GB 4789.2—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物菌落總數(shù)測定中的方法測定。

1.3.4.3 pH 的測定

準(zhǔn)確稱取5.0 g肉樣，加入50 mL蒸餾水，剪碎后按6 000 r/min分散30 s，勻漿用pH計在室溫下直接測定[6]。

1.3.4.4 脂質(zhì)過氧化（TBARS）的測定

使用丙二醛（MDA）測定試劑盒，其原理是MDA作為脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，與硫代巴比妥酸反應(yīng)形成加合物，通過532 nm吸光度定量。首先收集500 μL菌懸液，并在4 ℃和8 000 r/min下離心5 min。將細胞沉淀重懸在500 μL PBS中，立即浸入液氮中，2 min后取出在冰上解凍；將解凍液在4 ℃和8 000 r/min離心5 min，取100 μL上清到1.5 mL離心管，再加入200 μL MDA工作溶液混合；最后，將反應(yīng)混合物用沸水加熱15 min，冷卻至室溫，以6 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液檢測532 nm處的吸光度[6]。

1.3.4.5 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的測定

參照GB/T 5009.228—2016自動凱氏定氮法進行測定。

1.3.4.6 單增李斯特菌的測定

參照GB 4789.30—2016第二法進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗中每組數(shù)據(jù)均進行3次重復(fù)，使用IBM SPSS Statistics 26進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，并對試驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（ANOVA）進行分析。當(dāng)p＜0.05 時，認(rèn)為組間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍光殺菌技術(shù)關(guān)鍵參數(shù)的確定

2.1.1 藍光光源距離對殺菌效果的影響

圖1顯示，藍光殺菌可顯著殺滅單增李斯特菌，與空白對照組比較，光源距離40 cm的藍光能夠殺滅小部分單增李斯特菌（p＞0.05）。從 35 cm光源距離開始，隨著距離的縮短，存活的單增李斯特菌數(shù)目越來越少，20 cm光源距離的藍光幾乎將全部的單增李斯特菌殺滅（p＜0.05）。

圖1 藍光光源距離對殺菌效果的影響（*p＜0.05）

2.1.2 藍光照射時間對殺菌效果的影響

由圖2可以看出，0.5 h和1 h藍光照射能夠殺滅小部分單增李斯特菌（p＞0.05）。從2 h藍光照射開始，隨著照射時間的增加，存活的單增李斯特菌數(shù)目越來越少，4 h照射時間的藍光幾乎將全部的單增李斯特菌殺死（p＜0.05）。

圖2 藍光照射時間對殺菌效果的影響（*p＜0.05）

2.1.3 藍光殺菌關(guān)鍵參數(shù)的確定

在對光源距離、照射時間進行單因素試驗的基礎(chǔ)上，使用正交設(shè)計優(yōu)化二因素三水平得到最優(yōu)組合，以菌落數(shù)為評價指標(biāo)進行分析。最佳參數(shù)的試驗因素與水平如表2所示。

表2 藍光殺菌關(guān)鍵參數(shù)確定正交試驗因素水平表

極差值（R）反映的是因素對檢測指標(biāo)的影響程度，R值越大表明對殺菌效果的影響越大。由表3數(shù)據(jù)可以看出，藍光照射時間對殺菌效果的影響較大。根據(jù)K值確定最優(yōu)組合，光源距離和光照時間的水平分別為1和3時菌落數(shù)最低，即藍光殺菌的最佳參數(shù)為光源距離20 cm、照射時間4 h。

表3 正交試驗結(jié)果

考慮到實際操作的便捷性，在0～10 ℃銷售冷柜進行驗證時，選擇的最佳參數(shù)為光源距離30 cm、光照時間4 h。

2.2 藍光殺菌技術(shù)的驗證

2.2.1 藍光照射對產(chǎn)品感官的影響

由圖3可以看出，最優(yōu)組合與對照組相比，感官評分均成下降趨勢。在儲存前3 d，感官評分無顯著差異（p＞0.05），最優(yōu)組合在組織結(jié)構(gòu)、質(zhì)地口感、外觀色澤、風(fēng)味滋味方面與對照組相差不大。3 d后，可能由于微生物增值等因素，導(dǎo)致對照組感官評分顯著降低（p＜0.05）。

圖3 藍光照射對產(chǎn)品感官的影響

2.2.2 藍光照射對菌落總數(shù)的影響

如圖4所示，菌落總數(shù)整體呈上升趨勢，藍光照射對菌落總數(shù)有抑制作用，在儲藏4 d時對照產(chǎn)品的菌落總數(shù)達到（4.91±0.09）lg CFU/g，最優(yōu)組合的菌落總數(shù)為（3.90±0.07）lg CFU/g。至7 d時，對照產(chǎn)品的菌落總數(shù)達到（5.94±0.09）lg CFU/g，最優(yōu)組合的菌落總數(shù)為（5.15±0.08）lg CFU/g。表明藍光照射可抑制菌落增殖。可能是因為藍光（BL）激發(fā)細胞內(nèi)光敏劑如糞卟啉，這種光吸收過程導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生高能單線態(tài)氧（1O2）；1O2半衰期很短，會迅速產(chǎn)生活性氧物質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）；ROS隨后造成細胞內(nèi)生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸損傷，因為含巰基的蛋白質(zhì)[7]和核酸[8]的生物分子易于被ROS氧化；最終導(dǎo)致細胞死亡[9]。綜上，藍光照射可以達到一定的抑菌效果。

圖4 藍光照射對菌落總數(shù)的影響

2.2.3 藍光照射對pH的影響

牛肉在冷藏期間pH變化情況如圖5所示，隨著時間的延長，兩種產(chǎn)品的pH均呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能是產(chǎn)品在貯藏過程中被乳酸菌污染，乳酸菌繁殖產(chǎn)酸；還可能脂肪酸化和糖原分解產(chǎn)酸[10]；因產(chǎn)品存放時間較短，pH變化不明顯。

圖5 藍光照射對pH的影響

2.2.4 藍光照射對TBARS的影響

從圖6可以看出，在儲藏期間，對照組與最優(yōu)組合的TBARS值變化趨勢均與時間呈正相關(guān)，兩組的TBARS值均呈上升趨勢，這可能是由于不飽和脂肪酸在氧的作用下發(fā)生了脂質(zhì)氧化，其生成的醛和酮使得TBARS值升高[11]。貯存過程中，最優(yōu)組合與對照組的TBARS值無顯著差異（p＞0.05），表明藍光照射對牛肉的脂質(zhì)過氧化影響不大。

圖6 藍光照射對TBARS的影響

2.2.5 藍光燈照射對TVB-N的影響

由圖7可知，隨著時間的延長，兩組的TVB-N值均呈現(xiàn)上升的趨勢，并且對照組均顯著高于最優(yōu)組合（p＜0.05），這可能是因為肉中蛋白質(zhì)被降解為氨及胺類代謝產(chǎn)物的程度逐漸增大，使得揮發(fā)性鹽基氮值顯著升高[12]。對照組在第4天時TVB-N值高達（7.89±0.06）mg/100 g，而最優(yōu)組TVB-N值僅為（5.37±0.04）mg/100 g，說明最優(yōu)組對牛肉的TVB-N值的增長有抑制作用。直到第7天最優(yōu)組的TVB-N值僅為（18.6±0.59）mg/100 g，而對照組已達到（24.8±0.49）mg/100 g，這表明藍光照射有效抑制了產(chǎn)胺類微生物的生長，這與測定的菌落總數(shù)趨勢相一致。因此，與對照組相比，最優(yōu)組合有較好的保鮮效果。

圖7 藍光照射對TVB-N的影響

3 結(jié)論

通過正交試驗獲得了藍光殺菌的最優(yōu)組合，結(jié)果表明使用藍光照射后產(chǎn)品的保鮮效果增強，最優(yōu)組合為藍光光源距離30 cm、照射時間4 h。牛肉在0～10 ℃冷藏第7天時，其感官評分、菌落總數(shù)對數(shù)值、pH、TBARS和揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）分別為（68.3± 0.05）分，（5.62±0.05）lg CFU/g，（5.76±0.02），（2.71±0.03）mg/100 g和（18.6±0.59）mg/100 g，均顯著優(yōu)于對照組（p＜0.05），最優(yōu)組合能有效抑制牛肉腐敗變質(zhì)，保持產(chǎn)品新鮮度。

由于藍光波長短，穿透深度比較淺，無法對食品的內(nèi)部進行殺菌，但在一些散裝即食食品的銷售中進行應(yīng)用，可以有效地抑制售賣過程微生物增殖，具有較好的保鮮效果。本研究中發(fā)現(xiàn)，待處理樣品粗糙度、表面疏水性等性質(zhì)均會影響藍光殺菌的效果，但未見其相關(guān)研究報道，有待進一步研究。