花生紅衣原花青素對冷鮮豬肉脂質氧化的影響

黃武，侯曉杰，侯旭杰*，王強

1. 塔里木大學生命科學學院，南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室（阿拉爾 843300）；2. 中國農業科學院農產品加工研究所（北京 100193）

我國是生產和消費豬肉的大國，豬肉在國民的生產、生活中發揮重要作用[1]，但它在運輸儲藏期間易受溫度、氧氣等環境因素的影響而發生氧化變質，嚴重影響消費者的可接受性和相關商品貨架期。因此，抗脂質氧化成為冷鮮豬肉保鮮的關鍵。工業生產中最常用的方法是添加丁羥基茴香醚等人工合成添加劑來解決肉品的保鮮問題[2]。但人工抗氧化劑具有一定的安全風險，使用不當將危害人體健康，甚至有致癌的可能[3]。天然抗氧化劑因具有抗氧化能力強、安全無害等優點[4]，成為近年來研究的熱點。

花生紅衣是花生精深加工過程中的副產物，產量巨大，但利用率較低。經研究發現，花生紅衣中含豐富的多酚類物質，包括白藜蘆醇、原花青素、酚酸等[5-6]，其中原花青素是一種很強的抗氧化物質，它在人體內的抗氧化能力是VC的20倍，VE的50倍[7]，可用作安全無毒的新型天然抗氧化劑[8-9]。若能充分利用花生紅衣中的原花青素，將獲得較為可觀的經濟效益[10]。試驗以花生紅衣為原料，通過UPLC-Q-TOF/MS分析其中原花青素組成成分，以不同濃度原花青素和1%的VC對豬肉肥膘進行處理，研究不同冷藏時間段豬肉肥膘的酸價、POV和TBA值，考察原花青素對豬肉脂肪氧化的保護作用；比較VC和原花青素對ABTS自由基和DPPH自由基的清除情況，以期為花生紅衣原花青素作為天然抗氧化劑運用于肉制品加工中提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售新鮮豬肉，選取肥膘部分。

ABTS[≥98%，阿法埃莎（天津）化學有限公司]；DPPH[≥97%，梯希愛（上海）化成工業發展有限公司]；無水乙醇、TBA（天津市北聯精細化學品開發有限公司）；三氯乙酸（上海山浦化工有限公司）；過硫酸鉀、氫氧化鉀、冰乙酸、異丙醇、硫代硫酸鈉（天津市致遠化學試劑有限公司）；乙醚（成都市科隆化學品有限公司）；三氯甲烷（西安化學試劑廠）；VC（上海源葉生物科技有限公司）；碘化鉀（山東西亞化學工業有限公司）。試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜串聯質譜儀（Waters ACQUITY UPLC/Xevo G2 QTOF MS，Waters中國有限公司）；數控超聲波清洗器（SB-5200DT，寧波新芝生物科技股份有限公司）；循環水式多用真空泵（SHB-Ⅲ，鄭州長城科工貿有限公司）；數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋（EMS-20，金壇市科順儀器廠）；旋轉蒸發器（RE-3000A，上海亞榮生化儀器廠）；高速冷凍離心機（TGL-20br，上海安亭科學儀器廠）；紫外可見光分光光度計（UV-2450，島津公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生紅衣原花青素的制備

稱取干燥花生紅衣，粉碎成粉末狀，用適量石油醚對紅衣粉進行脫脂，參考王菲等[11]的方法對其中原花青素進行提取，經大孔樹脂純化，將純化后的溶液旋轉濃縮到一定程度后，真空冷凍干燥制成原花青素凍干粉備用[12-14]。

1.3.2 花生紅衣原花青素成分分析

稱取試驗所制純化后的原花青素凍干粉，用甲醇配制成質量濃度2 mg/mL溶液，過0.45 μm濾膜后進行UPLC-Q-TOF/MS分析。

色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters公司）；柱溫35 ℃。流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫程序為0～30 min，5%～90% B，30～45 min，90%～100% B，45～50 min，100% B。進樣量3 μL，流速0.3 mL/min。

質譜條件：質譜分析由Q-TOF MS（MS/MS）完成，電噴霧離子源（ESI），毛細管電壓3.00 kV；錐孔電壓40 V；離子源溫度和脫溶劑溫度分別為100 ℃和500 ℃；霧化氣（N2）和脫溶劑氣（N2）流速分別為100 L/h和950 L/h。質譜數據采集范圍50～1 200 mDa，采集時間0～60 min，掃描時間0.1 s。

1.3.3 抗脂質氧化研究

1.3.3.1 樣品處理

市購新鮮豬肉肥膘1 500 g，均分30等分，隨機分為6組，1～6組分別于無菌水、0.1% VC，以及0.05%，0.10%，0.15%和0.20%的花生紅衣原花青素溶液中浸漬1 min后，用保鮮膜包裹嚴實，置于4 ℃冰箱冷藏保存，分別在第1，3，5，7和9 d測定豬肉的酸價、POV、TBA值。

1.3.3.2 酸價的測定

按照GB/T 5009.229—2016《食品安全國家標準食品中酸價的測定》第一法 冷溶劑指示劑滴定法測定酸價。

1.3.3.3 過氧化物值（POV）的測定

按照GB/T 5009.227—2016《食品安全國家標準食品中POV的測定》第一法 滴定法測定過氧化物值。

1.3.3.4 TBA值（TBARS）的測定

參考芮懷瑾等[15]的研究方法。

1.4 自由基清除能力測定

1.4.1 溶液配制

1.4.1.1 VC溶液的配制

稱取0.01 g的VC試劑，用蒸餾水溶解，定量轉入100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容，搖勻得到質量濃度0.1 mg/mL的VC溶液；用蒸餾水稀釋，分別得到質量濃度為0.005，0.010，0.015，0.020和0.025 mg/mL的VC溶液。

1.4.1.2 樣品溶液的配制

稱取一定量純化后的原花青素凍干粉，配置成質量濃度0.15 mg/mL溶液，將其稀釋至質量濃度為0.002 5，0.005 0，0.007 5，0.010 0和0.012 5 mg/mL。

1.4.2 原花青素對DPPH自由基的清除能力

取5支試管，各取2.0 mL上述不同質量濃度樣液與2.0 mL質量濃度0.025 mg/mL的DPPH溶液加入同一試管中；取5支試管，各取2.0 mL上述不同質量濃度樣液與2.0 mL無水乙醇溶液加入同一試管中；另取1支試管，取2.0 mL DPPH溶液，加入2.0 mL無水乙醇溶液。將以上試管震蕩、搖勻，室溫下遮光保存30 min后于500 nm波長處測吸光度，以無水乙醇作空白對照，用VC溶液取代原花青素溶液按相同步驟進行試驗作對照。按照式（1）計算其DPPH清除率。

式中：Ai為DPPH溶液與原花青素溶液體系反應的吸光度；Aj為原花青素溶液與無水乙醇體系反應的吸光度；Ac為DPPH溶液與無水乙醇體系反應的吸光度。

VC溶液的DPPH清除率算取方法可代入式（1）計算。

1.4.3 原花青素對ABTS自由基清除能力測定

以無水乙醇作空白，取1.6 mL處理過的ABTS工作液于試管中，加入95%乙醇溶液0.4 mL以及樣品提取液0.4 mL，振蕩10 s，充分進行混合。混合后靜置6 min在734 nm下測其吸光度。采用式（2）計算其ABTS自由基清除率。

式中：A0為不加樣品溶液，但加入ABTS的吸光度；Ai加入樣品及ABTS的吸光度。

2 結果與分析

2.1 花生紅衣原花青素的成分分析

花生紅衣原花青素的UPLC色譜圖如圖1所示。通過UPLC-Q-TOF/MS分析，結果總結在表1中。試驗所用花生紅衣原花青素中，有至少5種單倍體和10種原花青素低聚物被檢測并鑒定。其中，單倍體含兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、原兒茶酸及表兒茶素衍生物等，低聚物中A型低聚體4種，B型低聚體6種，包括原花青素A1、A2和C1，已鑒定出的二聚體由表兒茶單體素通過A型連接鍵連接，或由表兒茶素沒食子酸酯與兒茶素通過B型連接鍵連接，三聚體由表兒茶素單體經B型連接鍵連接，或由表兒茶素和兒茶素經B型連接鍵連接。原花青素的出峰時間在4～7 min內較為集中，這可能是因為試驗所得原花青素的聚合度普遍較低，分子極性相對較大，相比于聚合度高、極性小的分子在色譜柱上吸附得不是很牢固，所以經過流動相的沖洗能在較短時間內形成峰圖。

圖1 花生紅衣原花青素純化物超高效液相色譜圖

表1 花生紅衣原花青素UPLC-Q-TOF/MS的解析結果

2.2 花生紅衣原花青素對冷藏豬肉酸價的影響

酸價是衡量脂肪中游離脂肪酸含量的一項指標，酸價的高低能夠反映脂肪質量的好壞。由圖2可知，各試驗組酸價均隨著試驗天數增長而升高，試驗組和對照組酸價均低于空白組，0.1%花生紅衣原花青素抑制效果最好，從總體來看，0.1%的VC溶液抑制效果強于0.05%，0.15%和0.20%的花生紅衣原花青素，而0.05%，0.15%和0.20%的花生紅衣原花青素抑制效果呈依次增大的趨勢，出現這種現象的原因還有待進一步的研究。

圖2 花生紅衣原花青素對冷藏豬肉酸價的影響

2.3 花生紅衣原花青素對冷藏豬肉POV的影響

POV是表示油脂和脂肪酸等被氧化程度的一項重要指標，其數值一般表示油脂的初級氧化程度。由圖3可知，各試驗組POV均隨著試驗天數增長總體呈線性增高趨勢。試驗組和對照組所測POV基本都低于空白組，0.2%的花生紅衣青素抑制效果最好，從總體來看，原花青素濃度越高，對冷藏豬肉脂肪的初級氧化抑制效果越好，而0.1%的VC抑制效果與0.15%的花生紅衣原花青素抑制效果大體相似。

圖3 花生紅衣原花青素對冷藏豬肉POV的影響

2.4 花生紅衣原花青素對冷藏豬肉TBA值的影響

TBA值是表示油脂酸敗程度的指標之一，其數值一般表示油脂的次級氧化程度。由圖4可知，各試驗組TBA值均隨著試驗天數增長總體呈線性增高趨勢。試驗組和對照組所測TBA值均低于空白組，0.2%花生紅衣青素抑制效果最好，從總體來看，原花青素濃度越高，其對冷藏豬肉脂肪的次級氧化抑制效果越好，而0.1%的VC抑制效果介于0.15%～0.20%花生紅衣原花青素之間。

圖4 花生紅衣原花青素對冷藏豬肉TBA值的影響

2.5 原花青素對DPPH自由基的清除能力

由圖5可知，原花青素與VC在各自濃度范圍內對DPPH自由基的清除能力呈增強趨勢。在相同質量濃度下，原花青素對DPPH清除能力明顯較VC強。原花青素中含有大量活性酚羥基，其清除自由基能力是VC的20倍，但由于花生紅衣原花青素提取物中含較多雜質，所得原花青素純度較低，使得自由基清除能力達不到原有效果，但相比于VC，花生紅衣原花青素能夠更好地清除DPPH自由基。

圖5 原花青素對DPPH自由基的清除能力

2.6 原花青素對ABTS自由基的清除能力

由圖6可知，原花青素與VC對ABTS自由基清除效果呈同等升高趨勢，但在相同質量濃度下，原花青素與VC對ABTS清除率比其對DPPH的清除率低，質量濃度0.005 mg/mL時，原花青素和VC對DPPH自由基清除率分別是71.5%和62.3%，而對ABTS自由基的清除率分別是29.6%和20.9%，兩者清除率相差明顯，說明花生紅衣原花青素能夠更好地清除DPPH自由基。相比于VC，花生紅衣原花青素對自由基的清除效果更加明顯。

圖6 原花青素對ABTS自由基的清除能力

3 結語

花生紅衣原花青素對豬肉脂肪氧化有一定抑制作用，而通過UPLC-Q-TOF/MS檢測分析，其中所含原花青素皆為單倍體或低聚體，與高聚體相比，低聚體原花青素具有更好的穩定性，且經自由基清除效果比較，花生紅衣原花青素抗氧化能力優于VC。

脂肪的脂質氧化測定是評價脂肪品質的重要指標，在食品工業生產中，生產者應盡量降低脂肪氧化率，以保證油脂產品的質量與安全，因此，有效、廉價、來源廣泛的脂質氧化抑制劑是生產者所期待獲取的。花生紅衣含有豐富的低聚體原花青素，具有良好的抗氧化效果，其作為脂質抗氧化劑有較為光明的發展前景，并為花生紅衣高值化利用提供理論依據。