響應面法優化酶解提取綏江苦丁茶香料浸膏的工藝

包秀萍，李鋒，劉友杰，李寶志，付祺，樸永革*

1. 云南瑞升煙草技術（集團）有限公司（昆明 650106）；2. 吉林煙草工業有限責任公司（長春 130000）

苦丁茶種類眾多，大致分為木樨科、冬青科、金絲桃科、紫草科、馬鞭草科。主要分布于西南地區和沿海多雨地區，沿海地區以冬青科苦丁茶最多，西南地區為木樨科的幾種女貞苦丁茶[1-6]。云南綏江苦丁茶屬于木樨科紫莖女貞，含有豐富的皂甙、萜類、黃酮類物質[7-11]，是上等的綠色健康佳品，其嗅香為清雅茶韻，口感津甜回甘，湯色為明亮的黃綠色。

酶法提取在天然產物提取中應用廣泛，在一定條件的水環境中充分破壞植物細胞壁，有效提升植物細胞中的有效組分的溶出，有關報道研究酶解提取冬青科苦丁茶中的熊果酸、酶法提取鐵觀音中的茶多酚、黃酮等物質[12-24]。但是對綏江紫莖女貞苦丁茶香料浸膏的酶法提取未有報道，通過響應面法優化[25-27]綏江苦丁茶香料浸膏的酶解條件，萃取其萜類等香味成分，并用氣相色譜-質譜法[28]對揮發性致香成分進行分析和鑒定，與未經酶解的綏江苦丁茶香料浸膏進行對比分析，為綏江苦丁茶作為香料浸膏的廣泛應用提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料和主要儀器、試劑

綏江苦丁茶（云南省綏江縣）。

Agilent 6890N/5975氣相色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫公司）；BUCHIR-3000型旋轉蒸發儀（瑞士BUCHI公司）；SHZ-D（Ⅲ）。蒸餾萃取裝置（自制）。

Viscoflow MG復合植物水解酶[活力80 U/g，諾維信（中國）生物技術有限公司]；乙醇[95%（V/V），食品級，云南汕滇藥業有限公司]；無水硫酸鈉（AR，廣東汕頭市西隴化工廠）；二氯甲烷（AR，天津市博迪化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

綏江苦丁茶為原料，酶解時以3倍水（原料質量計）為溶劑，按設計條件進行酶解，并加入10倍95%酒精進行回流提取，旋轉蒸發儀減壓蒸餾回收溶劑，所得樣品為綏江苦丁茶香料浸膏。

1.2.2 響應面法試驗設計

因素水平提取工藝設計：根據有關資料和預備單因素試驗，以酶解溫度、酶解時間和酶解pH為主要影響因素，以測得綏江苦丁茶香料浸膏樣品得率為考察指標，利用響應面法的Box-Behnken Design設計，每個因素取3個水平，以-1，0和+1編碼，以苦丁茶的萃取率為響應值進行萃取工藝因素水平設計（表1）。

表1 試驗因素水平編碼

萃取率按式（1）計算。

1.2.3 GC-MS分析條件

1.2.3.1 色譜條件

TR-5MS，60 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣，氦氣（99.999%）；進樣量1 mL；分流比15∶1；柱流速，恒流0.8 mL/min。程序升溫：初始溫度80 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的速率升至240 ℃，保持30 min。傳輸線溫度250 ℃；進樣口溫度250 ℃。

1.2.3.2 質譜條件

EI能量70 eV，溶劑延遲6 min，掃描離子范圍50～650 amu。定性分析采用NIST08質譜譜庫檢索；定量分析采用歸一化法。

2 結果與討論

2.1 響應面試驗結果及分析

2.1.1 響應面試驗結果

按照響應面法的Box-Behnken Design的試驗方案進行3因素3水平試驗，結果見表2。

表2 試驗設計及結果

試驗方案的15個試驗點中包括12個析因點（1～12）及3個中心點（13～15），以綏江苦丁茶香料浸膏的萃取率Y作為響應面分析的響應值。

2.1.2 響應面試驗結果分析

對表2試驗數據進行多元回歸擬合，得到綏江苦丁茶香料浸膏萃取率（Y）對酶解溫度（A）、酶解pH（B）和酶解時間（C）的二次多項回歸方程模型為：Y=-299.058 33+6.312 08A+54.120 83B+0.878 611C+ 0.255 000AB-0.003 083AC-0.005 833BC-0.068 333A2- 6.183 33B2-0.005 565C2。

該二次回歸方程方差分析結果和回歸方程系數顯著性檢驗結果見表3。3因素交互作用對綏江苦丁茶香料浸膏萃取率的響應面分析結果見圖1～圖6。

表3 回歸方程模型的方差分析結果

由表3數據和圖1～圖6可以看出，該模型統計學意義上差異極顯著（p＜0.01），失擬項不顯著，說明沒有未知因素對試驗結果干擾。模型的決定系數R2為0.990 7，修正決定系數R2為0.974 1，大于0.9，說明模型能解釋綏江苦丁茶香料浸膏萃取率響應值的變化。該模型與實際情況擬合較好，可用于分析和預測酶解萃取綏江苦丁茶的實際情況。

圖1 酶解溫度-酶解pH對萃取率的等高線圖

圖6 酶解pH-酶解時間對萃取率的響應面分析

圖2 酶解溫度-酶解pH對萃取率的響應面分析

圖3 酶解溫度-酶解時間對萃取率的等高線圖

圖4 酶解溫度-酶解時間對萃取率的響應面分析

圖5 酶解pH-酶解時間對萃取率的等高線圖

由表3可知，一次項A和B差異極顯著（p＜0.01），C差異不顯著（p＜0.01）。說明酶解溫度和pH對綏江苦丁茶香料浸膏萃取率有極顯著影響，而酶解時間影響不顯著。二次項A2、B2和C2均極顯著水平（p＜ 0.01）。A和B交互項差異也是極顯著（p＜0.01），說明這2個因素交互作用對綏江苦丁茶香料浸膏萃取率有極顯著影響。

2.1.3 驗證試驗

為進一步驗證該模型與測定的可靠性，對方程最優條件（酶解溫度53.57 ℃、酶解pH 5.32和酶解時間61.33 min）進行3次試驗（為方便操作，實際采用酶解溫度53 ℃、酶解pH 5.3和酶解時間60 min），綏江苦丁茶香料浸膏萃取率的平均值為40.45%，與通過Design Expert軟件優化后的回歸方程求解得到的預測值40.94%接近，這說明該模型較可靠，響應面法適用于對綏江苦丁茶香料浸膏的酶解萃取工藝進行回歸分析和參數優化。

2.2 綏江苦丁茶香料浸膏樣品的揮發性成分分析

通過酶解提取苦丁茶香料浸膏，能夠有效提高苦丁茶浸膏萃取率，與未酶解的苦丁茶香料浸膏對比，主要有效成分含量顯著提升，其揮發性成分總離子流圖見圖7。

圖7 綏江苦丁茶香料浸膏揮發性成分的總離子流圖

據表4可知，經酶解提取的綏江苦丁茶香料浸膏的揮發性成分共鑒定出化合物51種，與未經酶解提取的綏江苦丁茶香料浸膏（32種化合物）對比，多了19種成分，且苦丁茶中的主要化合物芳樟醇、α-松油醇、香葉醇、橙花醇、脂肪酸酯類等含量明顯高于未經酶解的苦丁茶香料浸膏，說明酶解能夠充分破壞苦丁茶細胞壁，利于苦丁茶細胞組織中的成分高效溶出，提高苦丁茶浸膏的萃取率，且提升苦丁茶中的主要揮發性化合物的含量。

表4 綏江苦丁茶香料浸膏揮發性化學成分 單位：μg/g

3 結論

綏江苦丁茶香料浸膏酶解提取工藝的最佳組合實際采用酶解溫度53 ℃、酶解pH 5.3和酶解時間60 min，進行驗證說明結果可靠。

揮發性成分分析結果表明：綏江苦丁茶香料浸膏中含有大量的致香成份，如芳樟醇、α-松油醇、香葉醇、橙花醇、脂肪酸酯類等物質，與未酶解的綏江苦丁茶香料浸膏揮發性成分對比，經過酶解提取工藝制備的綏江苦丁茶香料浸膏中的主要揮發性成分含量較未酶解的高2倍以上。除此之外，酶解提取還能夠充分溶出綏江苦丁茶中大量揮發性物質，有效增加綏江苦丁茶香料浸膏揮發性物質的豐富性，具有顯著的清雅茶香氣和香味，是一種高品質的香料浸膏。為提升綏江苦丁茶原料和綏江苦丁茶香料浸膏的利用奠定基礎。