響應(yīng)面法優(yōu)化閃式提取姜黃素工藝

董慶飛，蘇航，肖志勇，何洪，安鳳平，宋洪波*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院（福州 350002）；2. 福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院（福州 350002）；3. 福建拓天生物科技有限公司（福州 350002）

姜黃（Curcuma longa）是我國大力推廣種植及對外出口的一種藥食兩用的多年生草本植物[1]。姜黃素作為傳統(tǒng)中藥，是干燥姜黃根莖中的主要成分之一。由于其抗氧化、抗炎、護肝、抗病毒、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抑制衰老等生物活性，常用于功能性食品方面研究[2-3]，所以提取姜黃素及其性質(zhì)研究成為一大熱點。姜黃素的制備方法主要有酶法[4]、微波法[5]、超臨界CO2萃取法[6]、酸堿法[7]、超聲提取法[8]等。其中，提取效率最高的是酶法，但對酶的活性要求苛刻，對設(shè)備的要求高[4]。微波提取法的提取時間短、選擇性高，但泄漏的微波輻射會對人造成慢性損傷[5]。超臨界CO2萃取能維持生物活性，但不易大規(guī)模投入生產(chǎn)[9]。酸堿提取法提取成本低、工藝簡單，但提取過程中易使姜黃分解，并且對環(huán)境污染嚴(yán)重[7]。超聲提取法的提取率高、溫度低，但投資大、規(guī)模小，限制其發(fā)展[8]。提取姜黃素的傳統(tǒng)方法都有其局限性，考慮采用新的技術(shù)工藝提取姜黃素就顯得尤為重要。采用閃式提取法提取姜黃中姜黃素的研究較為罕見。閃式提取法具備耗時短、提取效率高、綠色環(huán)保、操作簡單等優(yōu)勢，且可在室溫條件下進行操作[10]，能在保證安全的情況下最大限度地保留姜黃的有效成分。這一項技術(shù)的特點比傳統(tǒng)方法更快速地從植物中提取目標(biāo)物質(zhì)。

試驗采用閃式提取法從姜黃中制備姜黃素，通過單因素試驗研究不同工藝因素對姜黃素得率的影響，在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法優(yōu)化試驗得到最優(yōu)提取工藝，以期為姜黃的開發(fā)提供可行途徑與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃（購于當(dāng)?shù)厮幍辏唤S素標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥ 98%，成都艾科達化學(xué)試劑有限公司）；無水乙醇（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

JHBE-50T閃式提取器（河南智晶生物科技股份有限公司）；UV-1780紫外分光光度計（島津儀器蘇州有限公司）；TGL-16醫(yī)用冷凍離心機（四川蜀科儀器有限公司）；BSA2202S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；150B搖擺式高速中藥粉碎機（浙江溫州瑞安市永歷制藥機械有限公司）；EYEL4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考王斌等[11]的方法測定，略有修改。準(zhǔn)確稱取姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品，配制標(biāo)準(zhǔn)品的梯度溶液，用80%乙醇溶液定容，用80%乙醇溶液作為空白對照。在430 nm處測定吸光度，記錄數(shù)據(jù)建立坐標(biāo)系，橫坐標(biāo)代表姜黃素質(zhì)量濃度（mg/mL），縱坐標(biāo)代表吸光度（AU），并計算出線性回歸方程：y=114.94x+0.131 1（R2= 0.991 1）。

1.3.2 姜黃素的提取

參考孫鵬堯等[12]的方法提取，略有修改。準(zhǔn)確稱量10 g粉碎過篩的姜黃粉末置于燒杯，按照一定的料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)添加至燒杯中，放置于閃式提取器下以一定轉(zhuǎn)速進行一定提取時間的制備。待提取結(jié)束后，在5 000 r/min、25 ℃條件下離心5 min，除去濾渣，取上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到濃縮液。準(zhǔn)確移取1 mL濃縮樣液，用80%乙醇固定體積至10 mL，參照

1.3.1 的方法測定吸光度。

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對姜黃素得率的影響

在料液比1∶30 g/mL、轉(zhuǎn)速5 000 r/min、提取時間60 s條件下，探究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（50%，60%，70%，80%和90%）對姜黃素得率的影響。

1.3.3.2 料液比對姜黃素得率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、轉(zhuǎn)速5 000 r/min、提取時間60 s條件下，考察不同料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）對姜黃素得率的影響。

1.3.3.3 提取時間對姜黃素得率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶30 g/mL、轉(zhuǎn)速5 000 r/min條件下，考察不同提取時間（40，50，60，70和80 s）對姜黃素得率的影響。

1.3.3.4 轉(zhuǎn)速對姜黃素得率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶30 g/mL、提取時間60 s條件下，考察不同轉(zhuǎn)速（2 000，3 500，5 000，6 500和8 000 r/min）對姜黃素得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

經(jīng)顯著性分析后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)料液比1∶30～1∶50 g/mL對姜黃素得率的影響較其他因素更低，所以選擇轉(zhuǎn)速、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)顯著影響姜黃素得率的3個因素作為考察變量，以姜黃素得率作為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken程序進行設(shè)計[13]，試驗設(shè)計因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素與水平

1.3.5 得率的計算

姜黃素得率按式（1）計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3次，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。使用Origin 8.0軟件繪圖，采用Excel 2016軟件、Design Expert 8.0.6.1軟件對試驗結(jié)果得出的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用SPSS 24.0軟件對試驗結(jié)果數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析（p＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對姜黃素得率的影響

圖1顯示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)逐漸提高，姜黃素得率呈現(xiàn)先增加后降低趨勢。乙醇體積分?jǐn)?shù)從50%增加到70%時，姜黃素得率呈現(xiàn)迅速升高趨勢，姜黃素得率在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時達到最高值。造成這種現(xiàn)象的原因可能是70%乙醇的介電常數(shù)更高，更有利于溶劑的滲透[14]。乙醇體積分?jǐn)?shù)高出70%，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，姜黃素得率卻出現(xiàn)明顯降低趨勢。這是因為乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%，由于高體積分?jǐn)?shù)乙醇的介電常數(shù)會下降，從而阻止姜黃素的滲出，因此姜黃素得率急劇下降[14]。這與吳妙鴻等[15]用超聲波輔助醇提取法從姜黃中提取姜黃素的研究結(jié)果基本一致。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對姜黃素得率的影響

2.1.2 料液比對姜黃素得率的影響

圖2顯示，隨著料液比不斷減小，姜黃素得率呈現(xiàn)先增加后降低趨勢。料液比從1∶10 g/mL減小到1∶30 g/mL時，姜黃素得率隨料液比減小而迅速升高，料液比1∶30 g/mL時達到最高，造成這種現(xiàn)象的原因可能是隨著溶劑增加，料液的濃度差也在增加，這有利于溶質(zhì)的擴散[16]。繼續(xù)減小料液比到1∶40 g/mL，得率并沒有顯著變化，可能是由于樣品已基本完成固液的轉(zhuǎn)移，對得率未造成明顯影響[17]。但繼續(xù)增加溶劑使料液比達到1∶50 g/mL，姜黃素的得率卻呈現(xiàn)出迅速下降趨勢，可能是由于溶劑比例增大使得閃式提取器的刀頭無法與樣品充分接觸，使樣品中溶質(zhì)難以溶出[18]。這與羊青等[19]用乙醇回流法從姜黃根莖中提取姜黃素的試驗結(jié)果類似，但可能是樣品差異等原因使得料液比1∶30～1∶40 g/mL范圍內(nèi)對姜黃素得率的影響不顯著。

圖2 料液比對姜黃素得率的影響

2.1.3 提取時間對姜黃素得率的影響

圖3顯示，總體上姜黃素得率隨著提取時間增加而呈現(xiàn)先增加后降低趨勢。提取時間從40 s增加到60 s時，姜黃素的得率隨提取時間逐漸延長而呈現(xiàn)明顯升高趨勢，得率達到最高點時的提取時間為60 s，可能是因為提取時間增加，充分的剪切使細胞膜破碎程度加大，增加姜黃素類化合物的溶出，得率增加[20]。提取時間延長到60 s以上，姜黃素得率呈現(xiàn)急劇降低趨勢，可能提取時間過久導(dǎo)致閃式提取器刀頭高速剪切作用使部分機械能轉(zhuǎn)化為熱能，引起液體溫度升高，高溫導(dǎo)致姜黃素類化合物分解[21]。該結(jié)果與張雄等[20]采用閃式提取法從猴頭菇中同步提取多糖和蛋白質(zhì)的研究結(jié)果大體一致。

圖3 提取時間對姜黃素得率的影響

2.1.4 轉(zhuǎn)速對姜黃素得率的影響

圖4顯示，姜黃素得率隨著轉(zhuǎn)速逐漸升高而呈現(xiàn)先升高后降低趨勢。轉(zhuǎn)速處于2 000～5 000 r/min范圍內(nèi)，姜黃素得率隨著轉(zhuǎn)速增大而明顯增大，轉(zhuǎn)速5 000 r/min時得率到達最高，可能是因為隨著轉(zhuǎn)速在原料顆粒表面產(chǎn)生較強的剪切及湍流、較高的負壓，從而促進姜黃素從細胞中釋放[22]。轉(zhuǎn)速從5 000 r/min逐漸升高到8 000 r/min，姜黃素得率急劇下降，可能是過高轉(zhuǎn)速的強剪切可一定程度破壞分子結(jié)構(gòu)[23]，因此使姜黃素得率下降。這與Cheng等[22]采用粉碎組織提取技術(shù)（STE）從五味子中提取木質(zhì)素的研究結(jié)果類似。

圖4 轉(zhuǎn)速對姜黃素得率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗分析

2.2.1 回歸模型的建立及方差分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，將料液比固定為1∶30 g/mL，以轉(zhuǎn)速、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)為試驗因素，以姜黃素得率為響應(yīng)值，利用Box-Behnken試驗設(shè)計對閃式提取姜黃素的工藝條件進行二次多項回歸方程的擬合及優(yōu)化。試驗結(jié)果見表2。

表2 姜黃素得率的響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果

根據(jù)表2的試驗結(jié)果，用Design Expert 8.0.6.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多項式擬合分析處理，通過計算得出姜黃素得率（Y）與轉(zhuǎn)速（X1）、提取時間（X2）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3）之間的二次多項回歸方程：Y=62.55+ 0.24X1+1.9X2+1.3X3-1.18X1X2-1.52X1X3+2.32X2X3-2.27X12-4.31X22-2.27X32。

為進一步分析獲得的回歸方程的擬合度，根據(jù)表2的試驗數(shù)據(jù)對模型進行ANOVA方差分析。如表3所示：擬合方程的p值小于0.000 1，說明試驗建立的模型極顯著；失擬項的p值為0.204 6，大于0.05，表明失擬項沒有顯著差異。回歸方程的確定系數(shù)為R2=0.991 2，表明建立的模型能解釋99.12%響應(yīng)值的變化[24]。該模型的擬合程度較好，能反映響應(yīng)面值的變化，誤差范圍小，可用該回歸方程預(yù)測和分析姜黃素得率的最優(yōu)條件。通過表3利用F檢驗可以觀察確定這三個因素對姜黃素得率的影響大小：提取時間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞轉(zhuǎn)速；從表3可以看出一次項提取時間（X2）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X3），交互項X1與X2、X1與X3、X2與X3，以及二次項X12、X22、X32對姜黃素得率的影響均達到極顯著水平。

表3 回歸系數(shù)和方差分析

2.2.2 響應(yīng)面交互分析

根據(jù)擬合的回歸方程，每2個因素之間對姜黃素得率作響應(yīng)面3D和二維等高線圖（見圖5）。響應(yīng)面的變化情況和等高線圖的疏密情況能夠直觀地反映因素之間的交互作用對姜黃素得率的影響，二維等高線圖表現(xiàn)為橢圓形或者響應(yīng)面3D圖表現(xiàn)為馬鞍形的時候，即為2個因素之間的交互作用顯著[26]。二維等高線圖的形狀愈接近橢圓形，說明其自變量之間的交互作用對因變量的影響愈大[27]。

兩因素之間的交互作用對姜黃素得率的影響見圖5。當(dāng)轉(zhuǎn)速、提取時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)三者中任意一個因素是零水平時，其余2個因素之間的交互作用對姜黃素的得率的影響均是隨著2個因素的升高而呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢。圖5（a）與圖5（b）等高線圖顯示的橢圓形大小基本一致，說明轉(zhuǎn)速與提取時間的交互作用和轉(zhuǎn)速與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對姜黃素得率影響的顯著性大小基本一致。圖5（c）等高線顯示的橢圓形表現(xiàn)得最大，曲率半徑較圖5（a）與圖5（b）更大[28]，說明提取時間與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用對姜黃素得率的影響極顯著。這一結(jié)果印證表3中回歸系數(shù)和方差分析的結(jié)果。3組響應(yīng)面3D圖均是平滑曲面，并且開口朝下，因此表明姜黃素得率的最大值在該測量范圍之內(nèi)。

圖5 各因素間的交互作用對姜黃素得率的影響

2.2.3 最佳條件預(yù)測與驗證

通過建立的模型預(yù)測，得到閃式提取姜黃素的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)74.507%、料液比1∶30 g/mL、時間63.682 s、轉(zhuǎn)速4 707.271 r/min，在該工藝條件下姜黃素的得率為63.17 mg/g。為方便實際操作，將試驗條件調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)74%、料液比1∶30 g/mL、時間64 s、轉(zhuǎn)速5 000 r/min。為驗證模型的有效性，在調(diào)整后的提取工藝條件的參數(shù)下進行3次平行提取試驗驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素得率為62.79±0.14 mg/g，與預(yù)測值（63.06 mg/g）相近并無顯著差異。該結(jié)果證實模型的可預(yù)測性，說明經(jīng)過響應(yīng)面優(yōu)化的提取條件重復(fù)性好，結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

以姜黃為原料，采用閃式提取法提取姜黃素。通過單因素分析，發(fā)現(xiàn)料液比對姜黃素得率整體上影響顯著，但在1∶30～1∶40 g/mL范圍內(nèi)對姜黃素得率的影響不顯著。通過響應(yīng)面分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間對姜黃素得率有顯著影響。提取姜黃素的最優(yōu)工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)74%、料液比1∶30 g/mL、提取時間64 s、轉(zhuǎn)速5 000 r/min，在此條件下姜黃素得率可達62.79±0.14 mg/g。該方法提取的姜黃素得率高于微波輔助酶解法（21.96 mg/g）[4]和超聲提取方法（9.618 mg/g）[8]。由此看出，閃式提取法在姜黃素提取中具有潛在應(yīng)用價值。