乳清蛋白源降糖肽的酶法制備及工藝優(yōu)化

范堯珠，張璐，曹加彪，李倩茹，王雪峰

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院（昆明 650201）

糖尿病是主要由遺傳及環(huán)境兩類因素共同作用，導(dǎo)致體內(nèi)胰島素分泌不足或胰島素作用受限而引起代謝紊亂，以及后續(xù)氧化還原平衡破壞，以高血糖為特征的一種終身慢性全身代謝疾病[1]，與癌癥、心血管疾病并稱為世界三大疑難雜癥[2]。到2008年，糖尿病影響世界上約4%的人群，并且根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation，IDF）在2015年的預(yù)測(cè)，這一數(shù)字到2025年將增加到5.4%[3]。隨著人民生活水平的提高，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入過(guò)剩，工作節(jié)奏加快和不健康飲食習(xí)慣的形成，糖尿病的防治問(wèn)題引起廣泛關(guān)注。

對(duì)于糖尿病的治療主要可從2個(gè)方面入手：一方面可以通過(guò)肌肉注射降低血糖水平的激素，另一方面可以服用降血糖藥物[4]。胰島素自被發(fā)現(xiàn)后，就成為治療糖尿病的主要手段，但是，胰島素不能口服，只能通過(guò)肌肉注射的方式降低患者血糖水平，對(duì)患者不免造成一些不便?？诜陌⒖úㄌ?、米格列醇、伏格列波糖等降糖藥物不僅可能會(huì)對(duì)人體的肝臟、腎臟產(chǎn)生潛在危害，而且會(huì)由于長(zhǎng)時(shí)間的給藥造成治療成本過(guò)高[5-7]。因此，研究安全且有效的降糖藥物已成為全世界關(guān)注的焦點(diǎn)[8]。具有降血糖功效的天然產(chǎn)物——植物源降糖多肽，因來(lái)源廣泛、副作用小等優(yōu)勢(shì)逐漸成為研究和開發(fā)降糖藥物的熱點(diǎn)[9]。降糖肽與其他小分子降糖物質(zhì)相比，用藥劑量更小，活性更高，且代謝終產(chǎn)物為易吸收的氨基酸[10]。苦瓜多肽、發(fā)酵大豆多肽、黑豆多肽等[11-15]被證明有降糖功效。研究發(fā)現(xiàn)一些降糖肽相對(duì)于臨床藥物的效果來(lái)說(shuō)與之相近，甚至有更好效果[16]。

試驗(yàn)以前期對(duì)乳清水進(jìn)行超濾、透析、冷凍干燥技術(shù)等獲得的乳清蛋白粉為原料，通過(guò)酶法制備乳清蛋白肽，以α-葡萄糖苷酶抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)酶解溫度、酶解pH、酶解時(shí)間、液料比4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化分析，確定最佳工藝條件。此次試驗(yàn)為乳清蛋白源降糖肽等高附加值產(chǎn)品的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原材料

乳清蛋白（由乳清水提取，在-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

1.1.2 主要試驗(yàn)器材、試劑

木瓜蛋白酶、α-葡萄糖苷酶（上海源葉生物科技有限公司）；對(duì)硝苯基-α-D吡喃半乳糖苷（PNPG，上海寶曼生物科技有限公司）；氯化鈉、PBS緩沖液（天津市鳳船化學(xué)試劑科技有限公司）；鹽酸[重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司]。

純水機(jī)[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；高速冷凍離心機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；電子天平、pH計(jì)[奧豪斯儀器（常州）有限公司]；電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific）；-80 ℃冰箱（長(zhǎng)虹美菱股份有限公司）；超濾杯（上海軒儀儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳清蛋白源降糖肽的制備

乳清蛋白源降糖肽的制備參考王雪峰等[17]的方法，并稍作修改。將乳清水過(guò)濾、透析冷凍干燥后，提取出蛋白質(zhì)，再用木瓜蛋白酶對(duì)其進(jìn)行水解，得到的乳清源蛋白多肽用α-葡萄糖苷酶對(duì)其生物活性進(jìn)行分析研究。

1.2.2 乳清蛋白的提取

用10 mol/L NaOH溶液將乳清水原料調(diào)節(jié)pH為7.5，加入12 mL 1 mol/L的CaCl2溶液在60 ℃水浴鍋中攪拌15 min，在高速冷凍離心機(jī)中離心35 min（4 000 r/min、4 ℃），取上清液進(jìn)行粗濾、微濾以及超濾（10 kDa），取上層超濾液透析24 h，進(jìn)行冷凍干燥，取得乳清蛋白。

1.2.3 酶解制備乳清蛋白降糖肽工藝過(guò)程

稱取0.1 g乳清蛋白凍干粉，加入純水，液料比為30∶1 mL/g，勻漿5 min，加入0.004 g木瓜蛋白酶，將酶解液放入50 ℃水浴中鍋中酶解5 h，酶解過(guò)程中保持pH 7.0，酶解結(jié)束后，在95 ℃條件下水浴5 min以滅酶，以4 000 r/min離心30 min，測(cè)定乳清蛋白肽對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

在其他條件一定的情況下，選擇初始pH（4，5，6，7，8和9）、酶解時(shí)間（2，3，4，5和6 h）、液料比（10∶1，20∶1，30∶1，40∶1和50∶1 mL/g）和酶解溫度（40，45，50，55和60 ℃）這4個(gè)因素作為單因素，研究每個(gè)因素對(duì)酶水解產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響。其中，1個(gè)作為單個(gè)因子時(shí)，其他3個(gè)單個(gè)因子的固定水平為初始pH 7.0、酶解時(shí)間5 h、液料比30∶1 mL/g、酶解溫度50 ℃。

1.2.5 響應(yīng)面法試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，以對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性為指標(biāo)，對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化。因素水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定

采用pNPG法測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性，參照Lordan等[18]的方法，并稍作修改。用20 mmol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖液（PB），將抑制α-葡萄糖苷酶與PNPG分別配制成200 U/mL和10 nmol/L的溶液，移取50 μL的樣品溶液和50 μL的α-葡萄糖苷酶溶液于96孔微量滴定板中，在37 ℃保溫10 min，加入50 μL PNPG溶液，用磷酸鹽緩沖液補(bǔ)充使各組體積相等，在37 ℃條件下充分反應(yīng)1 h，加入50 μL 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀確定每個(gè)樣品在405 nm處的最大吸光度。α-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算如式（1）所示。

式中：Ac為對(duì)照組吸光度，PB+酶+pNPG+Na2CO3；Ab為空白組吸光度，PB+PB+pNPG+Na2CO3；As為樣品組吸光度，多肽+酶+pNPG+Na2CO3；An為樣品空白組吸光度，多肽+PB+pNPG+Na2CO3。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，利用Design- Expert 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面分析、SPSS 24對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解單因素試驗(yàn)

2.1.1 pH對(duì)酶水解產(chǎn)物活性的影響

pH對(duì)酶水解產(chǎn)物活性的影響見(jiàn)圖1。pH的影響起伏較小，pH 5時(shí)，酶水解產(chǎn)物對(duì)α-葡糖苷酶的抑制率最好，為28.99%。當(dāng)pH 4或者pH＞5時(shí)，α-葡萄糖苷酶抑制率呈下降趨勢(shì)，這可能是因?yàn)槟竟系鞍酌冈诓贿m宜的環(huán)境導(dǎo)致酶的空間構(gòu)造發(fā)生變化，使部分酶活性降低所致[19]。由此可見(jiàn)，最佳pH為5。

圖1 pH對(duì)酶水解產(chǎn)物活性的影響

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)酶水解產(chǎn)物活性的影響

從圖2可以看出，抑制率在約4 h達(dá)到峰值，比3 h的產(chǎn)物抑制率提高9%左右，α-葡萄糖苷酶的抑制率在4 h后，可能是由于底物中包含可溶性和不溶性蛋白，可溶性蛋白質(zhì)的敏感肽鍵將在早期斷裂，而不敏感肽鍵將在后期斷裂。在5 h的酶水解之后，活性肽鍵被過(guò)度酶解，蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，因此酶產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶抑制率大幅降低[20]。因此，酶解時(shí)間應(yīng)控制在4 h。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物活性的影響

2.1.3 液料比對(duì)酶水解產(chǎn)物活性的影響

液料比對(duì)酶解產(chǎn)物α-葡萄糖苷酶抑制率的影響見(jiàn)圖3。液料比30∶1 mL/g時(shí)，α-葡萄糖苷酶的抑制率達(dá)到最高點(diǎn)，說(shuō)明此時(shí)液料比適當(dāng)，水解產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果最好。液料比大于30∶1 mL/g時(shí)，抑制率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是由于液料比增大，乳清蛋白水解產(chǎn)物在較多水中被稀釋，其功能因子被疏散，導(dǎo)致其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用減弱。因此，最佳液料比為30∶1 mL/g。

圖3 液料比對(duì)酶解產(chǎn)物活性的影響

2.1.4 酶解溫度對(duì)酶水解產(chǎn)物活性的影響

酶解溫度對(duì)酶水解產(chǎn)物α-葡萄糖苷酶抑制率的影響見(jiàn)圖4。40～45 ℃間溫度不斷升高，α-葡萄糖苷酶的抑制率不斷上升，溫度到達(dá)45 ℃時(shí)，酶促水解產(chǎn)物的抑制活性達(dá)到最大值40.72%，溫度高于45 ℃后，則出現(xiàn)下降現(xiàn)象，這是因?yàn)槊傅哪褪苤狄驕囟壬叨艿接绊?，溫度升高可能?huì)使酶部分變性，酶的活性受到抑制，即有活性的酶的量減少，影響酶解的速率[19]。因此，最佳酶解溫度為45 ℃。

圖4 酶解溫度對(duì)酶解產(chǎn)物活性的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝研究

2.2.1 響應(yīng)面法試驗(yàn)分析結(jié)果

由Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)的四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)該軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得出Y=36.60+1.64A+0.77B-0.27C+2.199D+2.46AB-0.53AC-1.51AD-3.46BC-2.71BD+0.91CD-10.75A2-9.00B2-8.67C2-4.39D2。

為檢驗(yàn)回歸方程的有效性，對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

根據(jù)表5可知該模型p＜0.01，說(shuō)明用木瓜蛋白酶酶解乳清蛋白制備降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率的回歸方程模型極其顯著，同時(shí)失擬差p為0.374 8＞0.05，不顯著，說(shuō)明所得回歸方程與實(shí)際擬合中非正常誤差所占比例較小，該模型具有合理性，回歸模型擬合程度良好，試驗(yàn)誤差小，能夠準(zhǔn)確地分析和預(yù)測(cè)制備乳清蛋白源降糖肽的工藝，具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。因此，該模型可用于分析和預(yù)測(cè)整體試驗(yàn)結(jié)果。

由表3中F值可知，4個(gè)因素對(duì)酶水解產(chǎn)物抑制活性的影響順序?yàn)镈＞B＞A＞C，其中酶解溫度和酶水解時(shí)間更為重要，故酶解溫度和時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物速率抑制活性具有更大作用。在所有平方項(xiàng)中，A2、B2和C2對(duì)降糖肽工藝影響達(dá)到極顯著水平（p＜0.01），D2的對(duì)降糖肽工藝影響達(dá)到顯著水平（p＜0.05）， 四因素相互作用影響相對(duì)較小。根據(jù)F值的大小，每種因素在木瓜蛋白酶對(duì)乳清蛋白酶解中，木瓜蛋白酶酶解乳清蛋白制備降糖肽影響α-葡萄糖苷酶抑制率的作用順序?yàn)槊附鉁囟龋久附鈺r(shí)間＞pH＞液料比。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)分析結(jié)果

使用Design-Expert 8.0.6軟件根據(jù)回歸方程做出響應(yīng)面圖。由圖5可知，在選定的試驗(yàn)條件之內(nèi)，固定一個(gè)變量，α-葡萄糖苷酶抑制率的大小先隨著另一個(gè)變量升高而增大，在達(dá)到最高值后會(huì)隨著另一個(gè)變量升高而減小，規(guī)律符合單因素試驗(yàn)結(jié)果。響應(yīng)面和等高線的稀疏程度可直觀地反映酶解溫度、酶解時(shí)間、液料比、pH之間交互作用對(duì)乳清蛋白降糖肽的α-葡萄糖苷酶抑制率的影響，當(dāng)?shù)雀呔€呈圓形時(shí)表示兩因素交互作用不顯著，而呈橢圓形或馬鞍形時(shí)則表示兩因素交互作用顯著。在所設(shè)計(jì)的4個(gè)影響因素中，酶解溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響最大，其次是酶解時(shí)間，然后是pH，液料比對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響最小，4個(gè)因素之間的影響無(wú)顯著交互作用（p＞ 0.05）。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖及等高線圖

2.2.3 最優(yōu)工藝條件確定和驗(yàn)證

使用Design-Expert 8.0.6軟件分析回歸方程，確定最優(yōu)工藝條件：酶解時(shí)間4.08 h、液料比29.77∶1 mL/g、酶解溫度46.05 ℃和pH 5.07。在此工藝條件下，酶水解產(chǎn)物的抑制率的預(yù)測(cè)值為36.9%。

考慮到試驗(yàn)條件和其他問(wèn)題的可行性，改良的酶解工藝條件為酶解時(shí)間4.1 h，液料比30∶1 mL/g，酶解溫度46 ℃，pH 5.1，在此條件下，鑒定并獲得乳清源蛋白降糖肽。為此，進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)（表4）。降糖肽對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為36.1%，接近預(yù)測(cè)值。證明響應(yīng)面分析方法對(duì)于酶促水解過(guò)程的優(yōu)化結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確和可靠。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)以乳清蛋白為材料，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上再結(jié)合響應(yīng)面的優(yōu)化，獲得酶法制備乳清蛋白降糖肽的最佳工藝條件：酶解時(shí)間4.1 h、酶解溫度46 ℃、pH 5.1、液料比30∶1 mL/g。在此條件下，酶解產(chǎn)物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為36.1%，試驗(yàn)表明，在此工藝條件下制備的乳清蛋白葡萄糖苷酶抑制劑降糖肽具有不錯(cuò)的降血糖活性，同時(shí)乳清蛋白作為天然成分，相對(duì)于人工合成藥物，乳清蛋白源降糖肽的副作用較小。此外，還可進(jìn)一步深入研究，包括對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定。此次試驗(yàn)可為乳清蛋白功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供參考依據(jù)。