酶解魚鰾蛋白制備膠原蛋白肽飲品

劉麗君，楊蘭欽

福州仁量生物制品有限公司（福州 350015）

我國水產資源豐富，水產品加工產生大量廢棄物，對其進行綜合再利用不僅節約資源，還能產生很大的經濟效益。眾多魚類加工廢棄物中都含有豐富的膠原蛋白，其中可食水生動物魚鰾的蛋白質含量達80%，是一種蛋白質含量高、脂肪含量低、富含多種礦物質及微量元素的優質膠原蛋白來源[1-2]。以魚鰾為原料，經過提取、精制生產，可得到相對分子質量低于10 000 Da的膠原蛋白肽。膠原蛋白肽具有較好的溶解性和熱穩定性，在體內可被直接吸收，利用率高，且具有抗氧化、抗疲勞、增強免疫力等諸多功效，可被廣泛應用于醫藥、保健食品、化妝品等領域[3-5]。近年來，膠原蛋白肽吸收性和生物活性的研究已取得較大進展[6-7]。有研究表明相比于蛋白質和游離氨基酸，肽類物質在腸道內不需降解直接被吸收，其轉運速度快，吸收率更高，且相對分子質量越小吸收率越高[8-9]。相比其他來源，魚源膠原蛋白肽的生物活性更優，且活性較高的膠原蛋白肽其相對分子質量一般在2 000 Da以下[10-11]。

膠原蛋白肽的提取方法有酸法提取、堿法提取、熱水提取、酶法提取[12-13]。其中，酶法提取具有提取率高、條件溫和、對膠原蛋白破壞性小等優勢，還可以利用蛋白酶的專一性控制水解程度，制備不同分子量的多肽[14]。應用較多的蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶。其中，木瓜蛋白酶具有對反應條件要求低、價格便宜等優點，從而得到廣泛應用。更有報道稱用木瓜蛋白酶水解魚鰾比其他蛋白酶產生的多肽具有更高的抗氧化能力[15]。

相對分子質量是膠原蛋白肽重要的質量指標[16]。針對魚鰾膠原蛋白肽的研究多以抗氧化性為主，以相對分子質量大小為提取目標的報道比較少見。故以膠原蛋白肽相對分子質量為考察指標，綜合考慮其吸收性和生物活性的影響，采用木瓜蛋白酶酶解魚鰾制備相對分子質量小于2 000 Da的膠原蛋白肽液，并測定其對DPPH自由基的清除率，配制成膠原蛋白肽飲品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

魚鰾（干制品，購于福州市永輝超市）；低聚果糖（液體，山東百龍創園生物科技股份有限公司）。

1.1.2 主要試劑

木瓜蛋白酶（廣州華琪生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；三氟乙酸（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；膠原蛋白肽檢測標樣（上海博升生物科技有限公司）；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH，上海源葉生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

電子分析天平（AEU-210型，日本島津公司）；電熱恒溫水浴鍋（HH-2型，余姚市科洋儀表廠）；高效液相色譜儀（LC-100型，上海伍豐科學儀器有限公司）；可見分光光度計（7230G型，上海儀電分析儀器有限公司）；離心機（TDL-80-2B型，上海安亭科學儀器廠）；pH計（PHS-25型，上海儀電科學儀器股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 魚鰾膠原蛋白肽液的制備。

干魚鰾加水浸泡過夜，洗凈瀝干水分后剪碎，加入干品質量35倍的去離子水，勻漿。在自然pH條件下加入適量木瓜蛋白酶進行酶解。于100 ℃水浴滅酶10 min，以4 000 r/min離心10 min，得到的上清液為魚鰾膠原蛋白肽液。

1.3.2 魚鰾酶解條件響應面優化試驗。

在前期單因素試驗基礎上，選擇酶解溫度、酶解時間、加酶量作為關鍵因子，應用軟件Design-Expert進行試驗設計，以相對分子質量低于2 000 Da的膠原蛋白肽所占比例為考察指標，確定最優酶解條件。因素水平設計見表1。

表1 酶解響應面優化試驗因素與水平

1.3.3 膠原蛋白肽相對分子質量的測定。

參照GB 31645—2018附錄A相對分子質量小于10 000 Da的膠原蛋白肽所占比例的檢測方法（高效體積排阻色譜法）[17]。采用的分離柱為TSK Gel G2000 SWXL，流動相為乙腈、水、三氟乙酸，體積比40∶60∶0.05，流速0.5 mL/min，檢測波長220 nm。標準品采用細胞色素C（MW12384）、抑肽酶（MW6512）、桿菌酶（MW1423）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（MW451）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（MW189）。相對分子質量的對數（lgMW）與保留時間的標準曲線方程為Y=-0.171 59X+6.837 2，相關系數R2=0.977 0，式中Y表示保留時間，單位為min，X表示相對分子質量的對數（lgMW）。根據標準曲線，用峰面積歸一化法計算相對分子質量低于2 000 Da的膠原蛋白肽所占比例。

1.3.4 DPPH自由基清除率的測定。

將最優酶解條件下得到的樣品溶液與試劑溶液混合均勻，用分光光度法測定其在517 nm處的吸光度[18]。

1.3.5 膠原蛋白肽飲品的生產操作要點及檢驗分析。

將魚鰾膠原蛋白肽液加入適量的低聚果糖進行調味，以改善其口感，增加其溶解性和透明度[19-20]。調配后進行灌裝扎蓋和濕熱滅菌，制成膠原蛋白肽飲品后，依據GB 7101—2015《食品安全國家標準 飲料》分析理化指標和衛生指標[21]進行檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 魚鰾膠原蛋白酶解響應面優化試驗結果

2.1.1 模型建立與方差分析

對表2試驗數據進行回歸擬合分析，得到相對分子質量小于2 000 Da的多肽占比Y的二次回歸編碼方程模型：Y=98.59+1.10X1+0.54X2+0.71X3-0.025X1X2+ 0.26X1X3-0.31X2X3-1.32X12-0.099X22-0.39X32。

表2 試驗設計及結果

由方程可看出各因素對低于2 000 Da的多肽占比影響程度為酶解溫度X1＞加酶量X3＞酶解時間X2，并且各因素對低于2 000 Da的多肽占比呈正相關。

由表3方差分析可知：p模型＜0.000 1，表明建立的回歸模型達到極顯著水平；FLf=0.41，pLf=0.754 6＞0.05，表明失擬項差異不顯著；相關系數R2=0.988 8，調整確定系數Radj2=0.974 4，表明該模型能描述97.44%的響應值變化。綜上表明，該模型擬合度高，能較好地解釋各因素與響應值之間的關系。

表3 回歸模型方差分析

上述回歸方程系數顯著性檢驗表明，模型的一次項X1、X3，二次項X12對低于2 000 Da的多肽占比影響極顯著（p＜0.000 1）；一次項X2，二次項X32及交互項X1X3、X2X3對低于2 000 Da的多肽占比影響顯著（p＜ 0.05）；其余項影響均不顯著。

2.1.2 酶解條件的優化和驗證。

通過Design-Expert軟件分析，結合實際生產應用，得出酶解魚鰾膠原蛋白的最優條件：酶解溫度62 ℃，酶解時間9 h，加酶量2.17%。在此條件下測得相對分子質量低于2 000 Da的多肽占比為99.0%，與理論預測值99.2%只相差0.2個百分點，說明所建立的數學模型對膠原蛋白肽的實際生產具有指導意義。

2.1.3 膠原蛋白肽分子量分布。

在最優酶解條件下得到的膠原蛋白肽相對分子質量分布色譜圖見圖1。

圖1 膠原蛋白肽相對分子質量分布色譜圖

經標準曲線計算得到膠原蛋白肽液相對分子質量的分布范圍，如表4所示。

由表4可知，膠原蛋白肽液相對分子質量主要集中在300～1 000 Da，占比為84.23%，相對分子質量小于1 000 Da的多肽占比為89.53%，說明在最優酶解條件下得到的膠原蛋白肽液主要是小分子肽，能夠有較好的吸收性。

表4 膠原蛋白肽液相對分子質量分布

2.2 DPPH自由基清除率的測定結果

在最優酶解條件下得到的魚鰾膠原蛋白肽液對DPPH自由基的清除率為85.4%，與孫燕麗等[15]報道的草魚魚鰾酶解液對DPPH自由基的清除率相比，高出6.5%。說明相對分子質量低于2 000 Da的魚鰾膠原蛋白肽液具有較高的抗氧化能力。

2.3 膠原蛋白肽飲品檢測結果

2.3.1 感官指標

色澤 滋味、氣味 狀態淡黃色液體 甘甜適口、味道柔和,無異味 清亮透明,無雜質

2.3.2 理化指標

鉛 (以Pb計)/(mg·L-1) 結果檢測值 標準＜0.05 ≤0.3 符合要求

2.3.3 衛生指標

符合商業無菌的要求。

3 結論

采用木瓜蛋白酶對魚鰾進行酶解，利用響應面模型對酶解關鍵因素進行探討，得到最優酶解參數：酶解溫度62 ℃，酶解時間9 h，加酶量2.17%。在該條件下制備魚鰾膠原蛋白肽，相對分子質量低于2 000 Da的多肽占比為99.0%，此膠原蛋白肽液對DPPH自由基的清除率為85.4%。利用魚鰾膠原蛋白肽液制備的膠原蛋白肽飲品，其產品符合飲料的理化衛生指標。后續將研究魚鰾膠原蛋白酶解液復配其他功效成分，制備具有不同保健功能的飲品。