精氨酸代謝酶ASS1/CAT1與結(jié)腸癌相關(guān)性研究

向鵬程， 屈少華， 韓俊毅

(同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院胃腸外科，上海 200120)

結(jié)腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一[1]。近年來對腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞的氨基酸代謝以及表觀遺傳學(xué)調(diào)控開展研究，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞有著異常的精氨酸代謝以及表觀遺傳學(xué)調(diào)控。先前研究發(fā)現(xiàn)，精氨酸代謝異常與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。在結(jié)腸癌患者血清中，精氨酸終端代謝物多胺水平升高，L-精氨酸水平降低，而且在癌組織中L-精氨酸以及L-瓜氨酸濃度較鄰近正常組織明顯蓄積增高，提示L-精氨酸在大腸癌組織中的生物利用度增高[3]。外源性的精氨酸通過陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白(cationic amino acid transporters, CATs)，主要為陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白-1(cationic amino acid transporter 1, CAT1)進(jìn)入細(xì)胞[4]。細(xì)胞內(nèi)精氨酸代謝產(chǎn)物又可以通過先后通過精氨酸琥珀酸鹽合成酶-1(argininosuccinate synthetase-1, ASS1)作用及一系列合成反應(yīng)，通過中間產(chǎn)物再次合成精氨酸。但在結(jié)腸癌中，有關(guān)精氨酸代謝的兩個關(guān)鍵酶ASS1、CAT1是否與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并不清楚。故本文擬初步探究ASS1、CAT1在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況及其與結(jié)腸癌臨床病理的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本

選取在2019年1月—2020年1月在同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院手術(shù)的結(jié)腸癌患者手術(shù)標(biāo)本，總計90例，癌組織標(biāo)本取材自腫瘤中心部位，癌旁組織標(biāo)本取材自距腫瘤邊緣2 cm處正常組織。術(shù)后病理由病理科醫(yī)師明確診斷，相關(guān)病理信息及病例資料如性別、年齡等從東方醫(yī)院住院醫(yī)師系統(tǒng)提取。

1.2 實驗試劑

ASS1一抗及CAT1一抗來自賽默飛公司(上海)，徠卡免疫組化試劑盒(阻斷劑+二抗+DAB顯色劑)試劑盒來自德國徠卡公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 TCGA數(shù)據(jù)庫分析 利用TCGA數(shù)據(jù)檢索結(jié)腸癌病種，分別下載ASS1、CAT1相關(guān)的病例數(shù)據(jù)，分析在非配對樣本中ASS1、CAT1在結(jié)腸癌癌組織及癌旁組織表達(dá)及其與結(jié)腸癌TNM分期的相關(guān)性。

1.3.2 組織芯片制備 對采集的組織標(biāo)本進(jìn)行梯度(70%、80%、90%、95%、100%)乙醇脫水，二甲苯浸泡透明，浸蠟。按照3.5 μm標(biāo)準(zhǔn)切片，每個蠟塊切一張大切片，H-E染色備用。針對癌組織及癌旁組織進(jìn)行定點標(biāo)記，點芯直徑大小為1.0 mm。從供體蠟塊取芯，填充到受體蠟塊并融合。按照4 μm規(guī)格陣列切片。放60 ℃烘箱烘烤0.5 h，二甲苯浸泡3次，每次10 min，無水乙醇浸泡3次，每次10 min，流水沖洗，芯片制作完成，備組織蛋白檢測。

1.3.3 免疫組織化學(xué)實驗 按常規(guī)進(jìn)行免疫組化測定，分別滴加一抗(ASS1或CAT1)、LeicaIHC試劑盒二抗和Leica IHC試劑盒顯色劑，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，組織芯片掃描儀掃描，量化評分。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 非配對樣本結(jié)腸癌TCGA數(shù)據(jù)庫分析

2.1.1 ASS1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其與TNM分期的相關(guān)性 從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取275例結(jié)腸癌組織及349例癌旁正常組織進(jìn)行對比分析，癌組織中ASS1表達(dá)明顯高于癌旁組織(P<0.05)，但結(jié)癌組織ASS1表達(dá)與TNM分期無關(guān)(P>0.05)，見圖1。

圖1 ASS1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其與TNM分期的相關(guān)性Fig.1 The expression of ASS1 in colon cancer and its correlation with TNM stagingA: 在275例結(jié)腸癌組織(T)及349例癌旁正常組織(N)中對比分析ASS1的表達(dá)差異，顯示在結(jié)腸癌中ASS1的表達(dá)要明顯高于癌旁組織；B: 分析ASS1的表達(dá)量在結(jié)腸癌各TNM分期中的差異，發(fā)現(xiàn)ASS1的表達(dá)于TNM分期無明顯相關(guān)性,Ⅰ～Ⅳ分別指TNM臨床病理分期Ⅰ～Ⅳ

2.1.2 CAT1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其與TNM分期的相關(guān)性 從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取275例結(jié)腸癌組織及349例癌旁正常組織進(jìn)行對比分析，癌組織中CAT1的表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且癌組織中CAT1的表達(dá)與TNM分期存在相關(guān)性(P<0.05)，見圖2。

圖2 CAT1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其與TNM分期的相關(guān)性Fig.2 The expression of CAT1 in colon cancer and its correlation with TNM stagingA: 在275例結(jié)腸癌組織(T)及349例癌旁正常組織(N)中對比分析CAT1的表達(dá)差異，顯示在結(jié)腸癌中CAT1的表達(dá)要明顯高于癌旁組織；B: 分析CAT1的表達(dá)量在結(jié)腸癌各TNM分期中的差異，發(fā)現(xiàn)CAT1的表達(dá)于TNM分期無明顯相關(guān)性,Ⅰ～Ⅳ分別指TNM臨床病理分期Ⅰ～Ⅳ

2.2 配對樣本結(jié)腸癌組織芯片分析

2.2.1 結(jié)腸癌ASS1的表達(dá)及與結(jié)腸癌病理、臨床特征的相關(guān)性 將90例結(jié)腸癌病例的癌組織及癌旁組織構(gòu)建組織芯片后，進(jìn)行IHC染色。結(jié)果采用免疫組化評分(histochemistry score, H-Score)，排除染色不全及缺失的位點，得到共計(癌組織75、癌旁組織67)142個位點；癌組織及癌旁組織配對位點58對，見圖3。其中142個位點中，ASS1均處于可檢測水平。58對配對樣本中，癌高于癌旁占46.6%(27/58)，癌低于癌旁占53.4%(31/58)。對58對配對位點H-Score評分進(jìn)行配對樣本t檢驗，結(jié)果提示，結(jié)腸癌、癌旁組織ASS1表達(dá)無差異，75例結(jié)腸癌組織芯片中ASS1表達(dá)與臨床病理特征無關(guān)，但癌及癌旁組織ASS1表達(dá)量比值與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性(P<0.05)，見表1。

圖3 結(jié)腸癌組織芯片中癌組織和癌旁組織ASS1表達(dá)Fig.3 Expression of ASS1 in cancerous tissue and paracancerous tissue in colon cancer tissue microarrayA: 在結(jié)腸癌組織中腺體明顯異型增生，腺體結(jié)構(gòu)混亂，ASS1染色呈陽性表達(dá)；B: 癌旁組織細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)整齊，ASS1染色呈陽性表達(dá)

表1 結(jié)腸癌組織與癌旁組織ASS1表達(dá)比值與臨床病例特征的相關(guān)性

2.2.2 結(jié)腸癌CAT1表達(dá)及與結(jié)腸癌病理、臨床特征的相關(guān)性 將90例結(jié)腸癌病例的癌組織及癌旁組織構(gòu)建組織芯片后，進(jìn)行IHC染色以檢測癌組織及癌旁組織CAT1的表達(dá)，結(jié)果用陽性率表示。排除染色不全及缺失的位點，得到共計(癌組織88、癌旁組織86)174個位點，癌組織及癌旁組織配對位點84對。其中癌組織有94.3%(83/88)表達(dá)CAT1，癌旁組織有78%(67/86)表達(dá)CAT1。84例配對樣本中，癌高表達(dá)占63.1%(53/84)，癌低表達(dá)占36.9%(31/84)，見圖4。對84對配對位點陽性率進(jìn)行配對樣本t檢驗結(jié)果顯示，結(jié)腸癌、癌旁組織CAT1表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但88例結(jié)腸癌組織芯片CAT1表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征無關(guān)。

圖4 結(jié)腸癌組織芯片癌組織和癌旁組織中CAT1表達(dá)Fig.4 Expression of CAT1 in cancerous tissue and paracancerous tissue in colon cancer tissue microarrayA: 在結(jié)腸癌組織中腺體明顯異型增生，腺體結(jié)構(gòu)混亂，CAT1染色明顯富集；B: 癌旁組織細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)整齊，CAT1染色可見少量陽性表達(dá)，明顯低于結(jié)腸癌組織

3 討 論

研究表明，外源性的精氨酸主要通過CAT1進(jìn)入細(xì)胞[4]。細(xì)胞內(nèi)的精氨酸代謝產(chǎn)物瓜氨酸可以通過ASS1及精氨酸琥珀酸鹽裂解酶(argininosuccinate lyase, ASL)作用及中間產(chǎn)物精氨酸琥珀酸鹽，再次合成精氨酸，其中關(guān)鍵限速酶則是ASS1。由此可見，ASS1、CAT1在結(jié)腸癌中是否表達(dá)就顯得尤為重要。

本文非配對樣本結(jié)腸癌TCGA數(shù)據(jù)庫分析提示，結(jié)腸癌組織ASS1表達(dá)明顯高于癌旁組織，但組織芯片分析則兩組無差異，這可能與TCGA數(shù)據(jù)庫分析是非配對樣本，而組織芯片是配對樣本有關(guān)。事實上，有關(guān)結(jié)腸癌中ASS1的表達(dá)及其與結(jié)腸癌臨床病理是否相關(guān)一直存在分歧。在一項超過600例的結(jié)腸癌組織芯片研究中，約18%的病例呈現(xiàn)ASS1的低表達(dá)，同時結(jié)腸癌細(xì)胞株中ASS1的表達(dá)也存在差異，SW480細(xì)胞持續(xù)表達(dá)ASS1，HCT116細(xì)胞中度表達(dá)ASS1，HT29和RKO細(xì)胞不表達(dá)ASS1[5]。另外一項關(guān)于結(jié)腸癌ASS1表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，ASS1是高表達(dá)的，并且表明抑制ASS1的表達(dá)會削弱結(jié)腸癌的致病性[6]。在細(xì)胞水平，不同細(xì)胞株間ASS1的表達(dá)呈現(xiàn)明顯差異，這說明不同組織類型的結(jié)腸癌，ASS1的表達(dá)也存在較大差異，這也可能是造成上述不同結(jié)果的原因之一。結(jié)腸癌ASS1表達(dá)與TNM分期是否相關(guān)，報道也多有矛盾。有報道認(rèn)為ASS1與結(jié)腸癌Dukes分期負(fù)相關(guān)[5]，但在另一篇報道中認(rèn)為ASS1高表達(dá)與結(jié)直腸癌惡性進(jìn)展相關(guān)[7]。本文結(jié)果表明，結(jié)腸癌ASS1表達(dá)與TNM分期無關(guān)；但結(jié)腸癌及癌旁組織比值與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示癌組織ASS1表達(dá)高于癌旁正常組織時更易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移，結(jié)腸癌及癌旁組織比值可能與患者預(yù)后相關(guān)。因此目前并不能完全明確ASS1與疾病進(jìn)展的相關(guān)相關(guān)性，下一步需要擴(kuò)大樣本量，對不同組織類型，不同部位的結(jié)腸癌對比分析。

有研究報道，CAT1作為氨基酸的重要轉(zhuǎn)運載體，其在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)是明顯升高的[8]。并且在近期研究中，與CAT1相似的功能的精氨酸轉(zhuǎn)運載體SLC6A14被發(fā)現(xiàn)在大腸癌中過表達(dá)，并且抑制其表達(dá)后能顯著抑制大腸癌細(xì)胞的生長能力[9]。另有研究表明CAT1在人體內(nèi)廣泛表達(dá)，但在結(jié)直腸癌細(xì)胞是相對高表達(dá)的[10]。目前有關(guān)結(jié)直腸癌中CAT1高表達(dá)機(jī)制尚不清楚。考慮到在肝細(xì)胞癌中miRNA的異常高表達(dá)抑制了CAT1的表達(dá)[11]，因此在結(jié)直腸癌中，CAT1的高表達(dá)也可能與miRNA的調(diào)控相關(guān)。本研究非配對樣本中CAT1在結(jié)腸癌表達(dá)明顯高于癌旁，并與TNM分期相關(guān)；配對樣本組織芯片分析亦表明，CAT1在癌組織中表達(dá)也明顯高于癌旁組織，但CAT1在癌及癌旁組織中并非均呈陽性表達(dá)，部分組織有表達(dá)缺失情況。癌組織CAT1表達(dá)與結(jié)腸癌病理特征無相關(guān)性。鑒于TCGA的非配對分析還是組織芯片的配對分析均顯示癌組織CAT1的表達(dá)是明顯高于癌旁，因此推測結(jié)腸癌組織的外源性精氨酸攝入是亢進(jìn)的。這與以往報道認(rèn)為結(jié)腸癌精氨酸富集和細(xì)胞生長亢進(jìn)與CAT1過表達(dá)有關(guān)的結(jié)論一致[8]。目前也鮮有有關(guān)CAT1與結(jié)腸癌進(jìn)展相關(guān)性的報道，僅有1篇報道認(rèn)為CAT1可能與結(jié)腸癌的手術(shù)后的肝轉(zhuǎn)移相關(guān)[12]，因此有必要對CAT1與結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)性，進(jìn)行深入探討。