林麝干擾素α基因克隆、表達及轉錄調控分析

楊威 伍茜 程建國 羅燕 王印 楊澤曉 姚學萍

（1. 四川農業大學動物醫學院，成都 611130；2. 四川養麝研究所，成都 611800）

林麝（forest musk deer，FMD）已列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》附錄Ⅱ，也是我國一級保護動物，其雄性分泌的麝香為名貴的中藥材和高級動物香料，具有重要的社會價值和經濟價值［1-2］。由于生態環境的破壞及過度的捕殺，野麝資源瀕臨滅絕，麝香資源瀕于枯竭。由于麝資源匱乏和麝香在國內外市場供不應求的矛盾，人工養麝前景十分廣闊。國際國內保護條例規定只有人工養麝獲取的麝香才允許進行合法的國際國內貿易［3］。但是目前對麝的一些疾病發生機制不甚了解，病原體的檢測技術不夠成熟，防治手段過于有限，林麝病癥不易外顯等原因，導致人工養殖林麝繁殖成活率偏低、群體死亡率高。目前，關于林麝疾病的研究報道中，除了研究較多的各類細菌導致的疾病外，也有林麝感染病毒死亡的相關報道［4］。因此，對林麝病毒性疾病的防治對林麝人工養殖產業的發展意義重大。

自1957年干擾素（interferon，IFN）被發現后的半世紀以來，干擾素一直是病毒學、細胞學、分子生物學、免疫學等相關領域的研究熱點。干擾素的生物學活性具有相對種屬特異性，即某一種屬動物產生的IFN只能對同種屬或種屬非常接近的動物有保護力。同時，干擾素的抗病毒作用是廣譜的［5］。干擾素是通過刺激機體自身抗病毒蛋白的表達來提升機體對病毒的抵抗作用從而達到抗病毒目的［6］。因此，干擾素在病毒性疾病的防治上，具有廣闊的前景。

近年來，隨著干擾素在一些畜禽病毒性疾病及腫瘤性疾病的治療方面取得良好療效，獸醫科研工作者愈加重視干擾素在動物體內的免疫特性及其臨床制品的研究，大熊貓、狐貍、水貂、貉等越來越多動物的IFN基因相繼被研究報道，動物基因工程干擾素的應用也會越來越廣泛［7-9］。林麝干擾素具有很高的臨床應用前景，研究林麝干擾素對林麝病毒性疾病的防治有重大意義。因此，本研究對林麝干擾素α進行了克隆與生物信息學分析，利用畢赤酵母表達系統對林麝干擾素α進行了外源表達，并對林麝干擾素α抗增殖作用和刺激抗病毒蛋白轉錄作用進行了研究，為林麝干擾素α的應用提供相關理論基礎，也為林麝病毒性疾病的防治提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

林麝血液采集于四川養麝研究所。畢赤酵母X33、表達載體pPICZα A、林麝肺臟成纖維細胞FMD-C1由四川農業大學動物檢疫實驗室保存。大腸桿菌DH5α購自天根生化科技有限公司；pMD19-T載體和T4連接酶購自大連寶日醫生物技術有限公司；2×Pfu PCR Mix、2×Taq PCR MasterMix和DNA分子質量標準購自天根生化科技（北京）有限公司；RNA提取試劑盒購于成都福際生物技術有限公司；cDNA合成試劑盒和DNA凝膠回收純化試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、預染蛋白分子量標準、CCK-8、小鼠抗6×His單克隆抗體、HRP標記山羊抗小鼠IgG單克隆抗體和DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；質粒DNA小量抽提試劑盒和SYBR Green 染料法Mix購自生工生物工程（上海）股份有限公司?？焖賰惹忻窫coR I、Not I和Sac I均購自莫納生物科技有限公司。氨芐青霉素、Zeocin、超濾離心管和酵母基因組提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。澳洲胎牛血清和DMEM培養基購自美國Hyclone公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA的合成 根據有關動物保護法，于林麝外周靜脈取血，枸櫞酸-枸櫞酸鹽-葡萄糖（ACD）抗凝，淋巴細胞分離液分離外周血淋巴細胞（PBMC），PBMC在1 μg/mL的刀豆蛋白A（ConA）誘導下37℃培養48 h后，按照RNA提取試劑盒說明，提取細胞總RNA，利用cDNA合成試劑盒合成cDNA，存于-70℃超低溫冰箱中。

1.2.2 引物設計與基因克隆 根據美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫已上傳的林麝近親物種牛、綿羊、山羊等IFN-α的核苷酸序列與林麝已上傳的基因組數據，設計克隆林麝IFN-α（FMD-IFNα）基因的引物與干擾素刺激基因（interferon-stimulated gene，ISG）的特異引物。本試驗檢測的林麝ISG為2′-5′-寡腺苷酸合成酶（2′-5′-oligoadenylate synthase，OAS）、病毒抑制蛋白Viperin（VIP）、黏病毒抵抗蛋白1（myxovirus resistance 1，Mx1）、干擾素刺激基 因 15（interferon-stimulated gene 15，ISG15） 和干擾素刺激基因56（interferon-stimulated gene 56，ISG56），并以β-actin為內參基因。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，本試驗所用引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

以林麝外周血淋巴細胞cDNA為模板，IFN-α F/R為引物，進行PCR擴增。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。DNA凝膠回收純化試劑盒回收目的基因片段，并與pMD19-T載體進行連接，轉化感受態大腸桿菌DH5α。以IFN-α F/R及M13 F/R為引物對鑒定轉化子，陽性轉化子送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 林麝IFN-α的生物信息學分析 測序結果信號峰圖使用Snapgene軟件校對，用DNAStar分析軟件分析比較，與GenBank公開的其他物種IFNα的基因序列進行同源性分析。運用ExPASy的ProtParam軟件分析FMD-IFNα蛋白編碼氨基酸的理化性質、MEGA 7.0軟件構建系統進化樹、NCBI中BLAST在線分析蛋白質保守結構域、SignalP 5.0 Server軟件分析信號肽預測及跨膜區、PSIPRED程序預測蛋白質二級結構、SWISS-MODEL軟件預測三級結構。

1.2.4 重組畢赤酵母pPICZα-IFNα-X33的構建 復蘇測序結果陽性的大腸桿菌，使用質粒DNA小量抽提試劑盒提取pMD19-T-IFNα質粒。將pMD19-TIFNα質粒作為模板，以ExIFNα-F/R為引物，進行PCR擴增，獲得表達片段。將表達片段和pPICZα A使用內切酶EcoR I和Not I雙酶切，酶切產物分別進行膠回收純化。使用T4連接酶連接FMD-IFNα表達片段與pPICZα A，構建表達載體pPICZα-IFNα，并轉化DH5α。用含有20 μg/mL Zeocin抗生素的 LB固體培養基篩選陽性轉化子。分別以ExIFNα-F/R和AOX I-F/R為引物，對生長出來的單個菌落進行PCR鑒定并送測序。

擴大培養陽性轉化子并提取pPICZα-IFNα質粒，并使用內切酶Sac I將其線性化。按照文獻［10］的方法制備畢赤酵母感受態，將線性化后的pPICZα-IFNα與畢赤酵母感受態混合，使用電轉儀進行電轉化。以 YPD 平板（100 μg/mL Zeocin）于 30℃培養酵母轉化子，并提取酵母轉化子基因組DNA。以轉化子DNA為模板，ExIFNα-F/R和AOX I-F/R為引物，對轉化子進行PCR鑒定并測序。

1.2.5 FMD-IFNα蛋白的誘導表達 將陽性重組子接種于BMGY培養基中，在30℃條件下220 r/min培養至OD600達到2.0-6.0，離心收集菌體，使用適量體積BMMY培養基重懸菌體沉淀，在30℃，220 r/min條件繼續培養，每24 h向培養基添加甲醇至終濃度為1%，誘導表達72 h。誘導結束的培養基離心取上清液，使用超濾離心管對上清液進行濃縮。取濃縮的上清液進行SDS-PAGE、Western blot分析，具體方法參考［11］。成功表達目的蛋白的陽性酵母重組子進行誘導表達甲醇濃度優化和誘導時間優化。甲醇濃度優化為陽性重組子于0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的甲醇濃度下，誘導表達72 h后取樣進行SDS-PAGE檢測。表達時間優化為陽性重組子于1.0%的甲醇誘導濃度下，在誘導24 h、48 h、72 h、96 h和120 h后取樣進行SDS-PAGE檢測。使用Ni-NTA蛋白純化試劑盒純化FMD-IFNα，并使用超濾管濃縮除鹽，用于后續試驗。

1.2.6 林麝IFN-α刺激林麝肺成纖維細胞FMD-C1 以10%胎牛血清濃度的DMEM培養基，37℃，5% CO培養FMD-C1細胞。將5×105個/mL，

22 mL/孔的FMD-C1細胞接種于12孔板中，待細胞長滿孔底的80%時，加入FMD-IFNα刺激細胞。劑量依賴性檢測：加入細胞培養液中的FMD-IFNα終濃度分別為400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL和50 ng/mL，以不加FMD-IFNα孔作為對照，孵育12 h，提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，-20℃保存。時間依賴性檢測：細胞培養液中加入400 ng/mL的FMD-IFNα，并分別于培養6 h、12 h、18 h和24 h后，提取細胞總RNA，以未加入FMD-IFNα孔作為對照進行后續試驗。

1.2.7 qPCR檢測林麝IFN-α對細胞內抗病毒基因表達影響 以FMD-C1 cDNA為模板，ISG（OAS、Viperin、Mx1、ISG15和ISG56）和β-actin引物對為引物進行PCR獲得目的片段，并連接pMD-19T構建重組質粒。使用重組質粒制備標準品，并以其為模板進行qPCR，建立標準曲線與溶解曲線，計算引物的擴增效率（Efficiency）與相關系數（r2）。再使用ISG與β-actin-F/R為引物，FMD-C1 cDNA為模板進行qPCR，檢測各個樣本中相關基因的Ct值，以Pfaffle法［12］進行轉錄水平計算。Pfaffle法計算公式為：

1.2.8 林麝IFN-α對林麝肺成纖維細胞FMD-C1的增殖抑制檢測 以 1×105個 /mL，100 μL/孔的FMD-C1細胞濃度接種于96孔板，于37℃，5% CO2培養24 h后，分別加入至終濃度為400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL和 50 ng/mL的 FMD-IFNα，以不加FMD-IFNα孔作為對照，每組設置5個復孔。孵育24 h后，每孔加入CCK-8 10 μL，孵育1.5 h，使用酶標儀測量每孔450 nm吸光度，使用600 nm的波長為參比波長，并計算細胞生長抑制率。計算公式為：細胞生長抑制率/%=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100。

2 結果

2.1 FMD-IFNα基因序列的擴增與克隆

林麝外周血淋巴細胞cDNA為模板，IFN-α F/R為引物，PCR擴增獲得約570 bp特異片段（圖1-A）。構建重組質粒pMD19-T-FMD-IFNα經M13-F/RPCR擴增獲得680 bp特異片段，符合試驗預期（圖1-B）。

圖1 FMD-IFNα的克隆及鑒定Fig. 1 Cloning and identification of FMD-IFNα

2.2 FMD-IFNα基因序列比對

通過對陽性克隆子測序，本次實驗獲得9種FMD-IFNα亞 型， 分 別 命 名 為 FMD-IFNα1-FMD-IFNα9，基因序列均為570 bp，編碼189個氨基酸。9種FMD-IFNα亞型的序列已上傳NCBI數據庫，登錄號為MW394230-MW394238。9種FMD-IFNα的氨基酸序列對比圖見圖2，其中包括了親緣關系較近的牛（BosIFN-αA），與親緣關系較遠的野豬（SusIFN-α4）和人（HomoIFN-α2）。信號肽預測結果顯示，FMDIFN-α前23位氨基酸為信號肽。9種FMD-IFN-α均包含4個半胱氨酸殘基，它們位于成熟蛋白序列的1、29、99和139位，可形成兩個二硫鍵，與其他哺乳動物IFN-α中的保守半胱氨酸一致。同時在4、26、39、110和139位含有的5個脯氨酸也與哺乳動物IFN-α 5個保守脯氨酸位點一致。

圖2 各亞型FMD-IFNα氨基酸序列同源性Fig. 2 Homology of amino acid sequence of each subtype of FMD-IFNα

9種亞型之間，核酸序列同源性為97.0%-99.6%，氨基酸序列同源性為93.7%-99.5%。FMDIFNα與同為反芻亞目的牛（BosIFN-αA）、山羊（CapraIFN-α）、印度黑羚（CervicapraIFN-α）、綿羊（OvisIFN-α1）的核苷酸同源性均大于94%，氨基酸序列同源性大于88%；與野豬（SusIFN-α4）的核苷酸同源性低于84%，氨基酸同源性低于70.9%；與人（HomoIFN-α2）的核苷酸同源性低于80.2%，氨基酸同源性低于65.4%。

利用MEGA 7.0軟件鄰近法對林麝、牛、綿羊、山羊、印度羚羊和作為外群物種的人和野豬的IFN-α氨基酸序列進行系統發生樹的構建，步長檢驗為1 000次，結果見圖3。由圖可知，林麝與綿羊、山羊、牛、印度羚羊共同構成一個主要分支，置信度為100，同時，9種林麝干擾素α再單獨形成一支。人和野豬（外群）分別形成一個單獨分支。

圖3 IFNα氨基酸序列系統發生樹Fig. 3 Phylogenetic tree of IFNα amino acid sequence

鑒于9條FMD-IFNα的核苷酸序列與氨基酸序列的高同源性，后續信號肽預測、二級結構預測、三級結構預測結果圖均以FMD-IFNα1亞型為代表進行展示。FMD-IFNα信號肽預測結果表明FMD-IFNα的前23個氨基酸為信號肽，成熟蛋白質由166個氨基酸組成。FMD-IFNα理化性質分析結果表明成熟FMD-IFNα蛋白分子質量為18.9 kD，等電點為8.46。二級結構預測結果表明IFN-α成熟蛋白的二級結構由5個主要的α-螺旋和無規則卷曲構成。FMDIFNα的三級結構見圖4，與牛、人的干擾素α的三級結構高度相似，均具有5個明顯的α-螺旋結構。

圖4 干擾素α三級結構對比Fig. 4 Comparison of the tertiary structure of interferon-α

林麝IFNα成熟蛋白保守結構域分析和功能位點預測結果見圖5。IFN-α成熟蛋白質第3-162位氨基酸構成一個干擾素α/β結構域；第3-155位氨基酸序列構成 I型干擾素結構域，屬于較大的螺旋狀細胞因子超家族。氨基酸序列的第5-20位和第77-99位分別包含一個IFNAR-1結合位點，第30-48位和第118-137位分別包含一個IFNAR-2結合位點。第78位氨基酸預測為N -糖基化位點，為保守結構域IFab上的N-糖基化位點。

圖5 FMD-IFNα成熟蛋白質的保守結構域預測Fig. 5 Prediction of the conserved domains of FMD-IFNα

2.3 FMD-IFNα的誘導表達

本試驗選擇FMD-IFNα1亞型進行外源表達及后續試驗。以陽性轉化子的pMD19-T-IFNα質粒為模板，ExIFNα-F/R為引物進行PCR擴增的結果見圖6-A，在約500 bp處有明顯條帶，符合預期。pPICZα-IFNα的PCR鑒定結果見圖6-B，符合預期大小1 044 bp，測序結果也符合預期，表達載體構建成功。

圖6 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 6 Agarose gel electrophoresis of PCR products

PCR鑒定pPICZα-IFNα電轉化的畢赤酵母，結果見圖7。以ExIFNα-F/R和AOX1-F/R為引物的PCR產物均符合預期，測序結果正確，重組畢赤酵母pPICZα-IFNα-X33構建成功。

圖7 陽性畢赤酵母轉化子PCR鑒定結果Fig. 7 PCR identification results of positive Pichia pastoris transformants

pPICZα-IFNα-X33初步誘導表達上清液的SDSPAGE電泳和Western blot均在15-25 kD之間有一明顯蛋白條帶（圖8），符合實驗預期。畢赤酵母表達的時間優化和濃度優化結果見圖9。結果表明pPICZα-IFNα-X33誘導表達的最佳甲醇濃度為1%，最佳誘導時間為96 h。

圖8 FMD-IFNα初步誘導結果Fig. 8 Preliminary expression results of FMD-IFNα

圖9 重組畢赤酵母誘導表達優化結果Fig. 9 Recombinant Pichia pastoris induced expression optimization results

2.4 林麝IFN-α對其通路上抗病毒相關基因表達的影響

林麝ISG和β-actin引物的qPCR熔解曲線均呈單一峰，無雜峰，引物特異性良好；OAS、Viperin、Mx1、ISG15、ISG56和 β-actin的 擴 增 效 率 分 別為 103.5%、107.9%、104.1%、100.1%、91.5% 和102.9%，符合qPCR引物要求；r2均大于0.99，具有良好的線性相關性。

FMD-IFNα刺激FMD-C1細胞的劑量依賴性見圖10-A。用4種濃度FMD-IFNα刺激FMD-C1細胞12 h后，FMD-C1的ISG轉錄水平有了較大提升，并且具有較明顯的劑量依賴性。Viperin、Mx1和ISG15在200 ng/mL處理組中的表達量顯著高于100 ng/mL處理組；400 ng/mL處理組的OAS、ISG15和ISG56表達量顯著高于200 ng/mL處理組（P＜0.05）。總體來看，400 ng/mL對FMD-C1的轉錄調控作用最強。時間依賴性試驗結果顯示FMD-IFNα對ISG轉錄的刺激主要集中于前6 h，在后面的18 h里，FMDIFNα對ISG轉錄的調控效果受到持續的限制，導致ISG mRNA量持續下降，具體結果見圖10-B。

圖10 FMD-IFNα調控ISG轉錄結果Fig. 10 Regulation results of FMD-IFNα on ISG transcription

2.5 林麝IFN-α對FMD-C1細胞增殖的抑制作用

使用CCK-8法對FMD-IFNα抑制FMD-C1細胞增殖能力進行了檢測，結果見圖11。FMD-IFNα對FMD-C1細胞的增殖抑制效果呈現明顯的劑量依賴性，100 ng/mL FMD-IFNα對FMD-C1細胞的增殖抑制效果顯著高于50 ng/mL FMD-IFNα（P＜0.05）；400 ng/mL FMD-IFNα對FMD-C1細胞的增殖抑制效果顯著高于200 ng/mL FMD-IFNα（P＜0.05），細胞增殖抑制率達到了最高的16.67%。

圖11 FMD-IFNα對FMD-C1細胞增殖的抑制作用Fig. 11 Inhibitory effect of FMD-IFNα on the proliferation of FMD-C1 cells

3 討論

隨著人工養麝產業的發展，林麝疾病防治研究也在深入進行。目前，林麝糞便中已檢測出多種病毒，并且已有林麝感染病毒致死的報道［4，13-14］。因此，林麝病毒性疾病的防治對人工養麝產業的發展具有深遠的意義。IFN-α是 I型干擾素的一種，具有多個亞型，是目前研究最多的干擾素，已經廣泛應用于多種疾病的治療，如：各種肝炎、人乳頭瘤病毒、水泡性口炎等病毒?。?5-17］。研究林麝IFN-α對于林麝病毒性疾病的防治具有長遠的意義。

本次試驗克隆的9種FMD-IFNα亞型的核苷酸序列具有高度同源性；信號肽組成與反芻類物種IFN-α相一致；半胱氨酸與脯氨酸位點均與已知哺乳動物 IFN-α一致［18-21］。FMD-IFNα的二級結構由緊密排列的α-螺旋結構域構成，這是 I型IFN都具有的相似的結構。FMD-IFNα的三級結構與牛和人IFNα高度相似。結構域預測結果表明FMD-IFNα可以與IFN-α受體（IFNAR-1和IFNAR-2）結合。IFNAR-1與IFNAR-2是干擾素生物活性至關重要的受體。系統發生樹顯示了FMD-IFNα與反芻亞目物種的近屬關系，同時9種FMD-IFNα單獨聚為一支，表現出一定的種屬特異性。為進一步研究FMD-IFNα的活性，本次試驗使用畢赤酵母表達體系完成了對FMD-IFNα的表達。

IFN-α具有強大的抗病毒作用，這個作用是通過調節數量龐大的IFN刺激基因（ISG）來實現的。ISG編碼的眾多蛋白質可以在細胞內建立起對病毒的廣譜抵抗狀態［22］。本次試驗檢測了FMD-C1細胞5個ISG（OAS、Viperin、Mx1、ISG15和ISG56）轉錄水平的變化。OAS可以抑制病毒蛋白合成及病毒復制；Viperin能夠抑制病毒的出芽及釋放；Mx1可以抑制病毒核酸進入胞內；ISG15通過將靶蛋白ISG化修飾來調節病毒和宿主蛋白的功能，抑制病毒的復制、出芽、釋放；ISG56與其他家族蛋白以及數種RNA結合蛋白形成復合體，從而清除病毒［23］。試驗結果表明，FMD-IFNα能顯著提高FMD-C1細胞5個ISG的轉錄水平。400 ng/mL FMD-IFNα刺激FMD-C1細胞6 h使Viperin轉錄水平達到了對照組的近3 000倍，Mx1、ISG15和ISG56的轉錄水平也是提高了100-300倍。

臨床研究表明，IFN治療期間，ISG的誘導水平差異很大，表達水平通常取決于時間，劑量和細胞類型［24］。大劑量IFN-α作用后，可迅速發生IFN信號傳導并激活ISG轉錄，但ISG mRNA積累量的峰值都是出現在6 h之前，并于6 h之后快速下調［25-26］。本試驗結果表明FMD-IFNα上調FMD-C1細胞ISG轉錄水平作用具有劑量依賴性，并于前6 h時效果最強，與相關報道一致。ISG轉錄水平的快速下調是由多種機制促成的，除了相關受體的缺失，更主要的機制是產生了信號抑制因子，如：SOCS1、STAT1β 等［27-28］。SOCS1可 與 IFN-α 受 體 IFNAR1結合，從而阻斷STAT1的激活；STAT1β是STAT1的另一種剪接變體，可結合DNA但不能激活蛋白質的轉錄。只要IFN-α存在，就能使受體細胞脫敏持續存在。

據文獻報道IFN-α可以抑制成纖維細胞增殖［29-30］。FMD-IFNα也能抑制FMD-C1細胞的增殖，且呈劑量依賴性，與陳君毅等［31］、于宏等［32］研究結果一致。IFN-α抑制細胞增殖是通過調節細胞分裂周期，并誘導部分細胞凋亡實現的［33-34］。IFN-α會抑制細胞由G0/G1期向S期的過渡，并促進G0/G1期細胞的凋亡［35］。目前已知的IFN-α阻滯G0/G1期細胞的機制包括調控p21基因的表達、抑制細胞周期蛋白依賴性激酶2（Cdk2）活性、降低E2F轉錄因子與DNA結合活性等［36］。此外，IFN-α會推遲細胞進入G2/M期，延長細胞處于S期的時間［37］。Detjen等［38］研究表明IFN-α延長細胞從S期進入G2/M期的作用與細胞周期蛋白B（Cyclin B）表達的抑制，細胞分裂周期基因2（Cdc2）蛋白活性的降低有關。

4 結論

本研究成功克隆9種林麝IFN-α基因序列，進行了生物信息學分析，并使用畢赤酵母表達系統實現了表達，最后研究了IFN-α對FMD-C1細胞的ISG轉錄調控作用和抗增殖作用，為進一步研究林麝干擾素α的抗病毒作用和免疫調控作用奠定了基礎。