針刺調(diào)節(jié)缺血性中風(fēng)大鼠腸道中短鏈脂肪酸、氧化三甲胺的研究※

張忠平，張海月

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

中風(fēng)會(huì)誘發(fā)身體多種病理、生理學(xué)反應(yīng)，如影響肺、心、免疫系統(tǒng)和腸道功能等[1]。研究表明，腸道菌群影響中風(fēng)患者的轉(zhuǎn)歸，腸道微生物組會(huì)產(chǎn)生大量的生物活性代謝產(chǎn)物，通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)或傳入神經(jīng)元途徑影響大腦功能[2]，其中以乙酸、丁酸和丙酸為主的短鏈脂肪酸(SCFA)代謝物已被證明可輕易穿越血腦屏障[3]。研究表明，腸道菌群代謝物氧化三甲胺(TMAO)會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化，如增強(qiáng)巨噬細(xì)胞膽固醇的積累、泡沫細(xì)胞形成、動(dòng)脈壁促炎性變化、促進(jìn)血小板反應(yīng)性增強(qiáng)和動(dòng)脈血栓形成[4]。課題組前期研究已經(jīng)證明，腸道菌群在中風(fēng)轉(zhuǎn)歸中的重要作用，本研究以大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型大鼠為研究對(duì)象，探究針刺對(duì)缺血性中風(fēng)SCFA、TMAO的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究方案進(jìn)行，并得到黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(H20201001)。SPF級(jí)雄性大鼠50只，來源于哈爾濱市醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。大鼠周齡6～8周，正常飼養(yǎng)、光照，適應(yīng)環(huán)境1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將大鼠隨機(jī)分為針刺組、手法組、電針組、手術(shù)組和空白組，每組10只。造模過程中無大鼠死亡。所有分析均由不知道分組情況的研究人員進(jìn)行。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MCAO模型制備 異氟烷吸入麻醉大鼠，在耳朵和眼睛之間切開一條切口，露出顳骨。將激光多普勒探針固定于大腦中動(dòng)脈區(qū)域上方的頭骨上，并將大鼠置于仰臥位。在中線頸部切開1個(gè)切口，分離并結(jié)扎頸總動(dòng)脈和左頸外動(dòng)脈。將1條20 mm的漁線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，并通過激光多普勒血流信號(hào)減少情況確認(rèn)大腦中動(dòng)脈閉塞。其中，針刺組、手法組、電針組接受MCAO模型建立，閉塞120 min后將動(dòng)物重新麻醉并除去魚線。手術(shù)組接受相同的手術(shù)程序，只是將魚線插入并立即取出。對(duì)照組未執(zhí)行任何操作。整個(gè)手術(shù)過程使用加熱墊保持大鼠體溫恒定。

2.2 穴位及針具 穴位:百會(huì)、膈俞、脾俞、腎俞、后三里，穴位和針刺方法參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[5]。針具:安迪牌0.25 mm×25 mm一次性針灸針。

2.3 干預(yù)方法

(1)針刺組 固定MCAO模型大鼠，選取以上穴位，用75%酒精棉球常規(guī)消毒皮膚，快速針刺，深度為12.5 mm，給予捻轉(zhuǎn)手法1 min，針下出現(xiàn)緊滯感后，不做任何操作，留針15 min。每日1次，連續(xù)14 d。

(2)手法組 固定MCAO模型大鼠，選穴、消毒、針刺方法、深度同針刺組。針刺后，行捻轉(zhuǎn)手法1 min。針下出現(xiàn)緊滯感后，行搓針手法，達(dá)到氣滿針搖為宜，留針15 min。每日1次，連續(xù)14 d。

(3)電針組 固定MCAO模型大鼠，選穴、消毒、針刺方法、深度同針刺組。針刺后，行捻轉(zhuǎn)手法1 min，針下有緊滯感后，同側(cè)膈俞、腎俞接電針治療儀，膈俞接正極，腎俞接負(fù)極，給予斷續(xù)波，頻率2/10 Hz，時(shí)間15 min。每日1次，連續(xù)14 d。

(4)手術(shù)組、空白組 每日固定大鼠，不做任何治療，每次15 min。連續(xù)14 d。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 標(biāo)本采集 收集不同組別大鼠干預(yù)前后的糞便，使用16S rDNA測(cè)序與分析方法檢測(cè)SCFA、TMAO含量。

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料如符合正態(tài)分布采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，若方差不齊或不滿足正態(tài)分布則采用秩和檢驗(yàn)，以中位數(shù)(四分位間距)[M(Q)]表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3 結(jié)果 干預(yù)前，MCAO大鼠的腸道菌群出現(xiàn)明顯紊亂現(xiàn)象，針刺組、手法組、電針組SCFA含量(乙酸、丙酸、丁酸)顯著降低，明顯低于手術(shù)組和空白組(P＜0.05);針刺組、手法組、電針組、手術(shù)組TMAO含量顯著升高，明顯高于空白組(P＜0.05)。見表1。干預(yù)后，針刺組、手法組、電針組SCFA含量升高，TMAO含量降低，與手術(shù)組、空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且手法組優(yōu)于針刺組、電針組(P＜0.05)。手術(shù)組、空白組觀察干預(yù)前后變化不顯著。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)前后短鏈脂肪酸、氧化三甲胺比較[logN/g,M(Q)]

4 討論

現(xiàn)代研究表明，中風(fēng)后的恢復(fù)過程是一個(gè)多細(xì)胞過程，包括神經(jīng)元、駐留的免疫細(xì)胞和侵襲大腦的細(xì)胞[10]。中風(fēng)可通過改變腸道微生物組，對(duì)中風(fēng)預(yù)后產(chǎn)生影響。目前，腸、腦相互作用的機(jī)制尚不明確，根據(jù)現(xiàn)有的關(guān)于急性腦損傷和恢復(fù)期菌-腸-腦軸的機(jī)制分析，中風(fēng)后營(yíng)養(yǎng)不良會(huì)影響關(guān)鍵微生物群衍生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而影響免疫穩(wěn)態(tài)，直接影響中風(fēng)的預(yù)后。SCFA、TMAO是腸道微生物組的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，通過影響T細(xì)胞功能，間接調(diào)節(jié)神經(jīng)再生環(huán)境，以影響中風(fēng)后的恢復(fù)能力[11]。

干預(yù)后，針刺組、手法組、電針組SCFA含量提高，TMAO含量降低，與手術(shù)組、空白組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且手法組優(yōu)于針刺組、電針組(P＜0.05);而手術(shù)組、空白組干預(yù)前后變化不顯著。該結(jié)果提示手法組可明顯調(diào)節(jié)腸道菌群SCFA、TMAO含量，從而減輕神經(jīng)功能損傷，促進(jìn)腦組織功能恢復(fù)，縮短腦缺血后期康復(fù)時(shí)間窗。相關(guān)研究證實(shí)，針刺可調(diào)節(jié)腸道免疫炎性反應(yīng)，通過改善腸道菌群的多樣性，發(fā)揮針灸的治療作用[12]。陳素輝等[13]發(fā)現(xiàn)，在中風(fēng)后急性干預(yù)期，針刺百會(huì)和足三里可調(diào)節(jié)大鼠腦缺血損傷區(qū)白細(xì)胞介素-6的表達(dá)，從而干預(yù)腦缺血再灌注損傷大鼠的炎性反應(yīng)。本研究選穴中，百會(huì)為諸陽之會(huì)，通行百脈，調(diào)節(jié)十二經(jīng)氣血，為醒腦開竅要穴;脾俞、腎俞應(yīng)用搓針調(diào)氣手法可補(bǔ)氣血生化之源，有效調(diào)節(jié)臟腑經(jīng)氣;膈俞為血會(huì)，后三里為調(diào)節(jié)胃腸氣血要穴。各穴相配，手法相應(yīng)，可有效調(diào)節(jié)腸道菌群變化。

綜上所述，腸道菌群失調(diào)是影響中風(fēng)的重要代謝機(jī)制，通過調(diào)控腸道菌群可影響其與腸外器官的通訊，但腸道菌群介導(dǎo)的免疫炎癥因子、神經(jīng)遞質(zhì)如何調(diào)控中風(fēng)病理過程，具體機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察。