巨核細胞在ITP 患者中的診斷價值及治療后HPA 的表達效果

馮于，劉學文，劉明君，張坤，卓麗霞

1.內蒙古科技大學包頭醫學院第二附屬醫院血液內科，內蒙古包頭 014030；2.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院血液內科，內蒙古包頭 014010

原發性免疫性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytoenia purpura,ITP)是臨床上因血小板計數減少引起的最常見的出血性疾病，主要與體液免疫和細胞免疫紊亂有關[1-3]。ITP 成人發病率為5/10萬～10/10 萬，60 歲以上老年人是高發群體，育齡期女性略高于同年齡組男性[4]。因其發病機制復雜，臨床表現與治療效果各不相同[5]。ITP 主要表現為皮膚黏膜出現瘀點、瘀斑、紫癜，口腔血皰，甚至出現視物模糊、眼底出血等癥狀[6-8]。約有半數ITP 患者會出現疲乏狀態，部分患者會合并記憶力減退和注意力不集中等情況[9]。HPA 是血小板膜糖蛋白上的特異性抗原表位，其基因呈現高度多態性[10]，誘導內部隱性表位暴露，巨噬細胞識別后上調刺激分子，引起一系列自身免疫反應，破壞血小板，巨核細胞計數增高及生長、成熟障礙，致使血小板不足而引起ITP。臨床分析HPA 與ITP 相關性的研究較多，對ITP 治療后HPA 的表達的研究較少。故本研究選取2020 年11 月—2021 年11 月包頭醫學院第一附屬醫院和包頭醫學院第二附屬醫院收治的ITP患者57 例作為研究對象，通過形態學角度分析罹患ITP 時的巨核細胞（megakaryocyte,MK）的變化，并經艾曲波帕治療后，觀察HPA 的表達及對療效的預測作用，為臨床醫師提供診治資料。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院收治的ITP 患者57 例（ITP 組），另選取同期正常者56 名（正常組）。ITP 組男21 例，女36例，平均年齡（52.87±3.36）歲。正常組男22 例，女34 例，平均年齡（53.04±3.40）歲。兩組一般資料對比，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經醫學倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

納入標準：符合成人ITP 的診斷標準[4]：至少連續2 次血常規檢查顯示PLT 計數減少，外周血涂片鏡檢血細胞形態幾乎正常。PLT 計數<100×109/L；患者皮膚出現瘀斑、出血點或臟器及黏膜發生出血等；MK 計數正常或增加，伴成熟障礙；家屬簽署知情同意書；臨床資料完整。排除標準：系統性紅斑狼瘡者；先天及自身免疫性疾病、再生障礙性貧血者；具有精神類疾病或溝通有障礙者。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 口服艾曲波帕（進口藥品注冊證號H20170387），25 mg/d，依據病情及PLT 調整藥物口服劑量。

1.3.2 觀察方法 使用巨核細胞流式檢測抗體試劑，選取BM 取材、染色、涂片良好的標本進行MK 標化記數。在涂片體尾交接處按順序用油鏡分類20～40個MK，對>40 個MK 或<20 個MK 者根據其實際數目計算。巨核細胞分類包含原幼、顆粒、裸核、產板4型，并計算各型所占比例。采用定量積分、統計方法對MK 退行性變、顆粒及胞漿進行分析。

1.3.3 HPA 采集 ①儀器：使用ELISA 抗HPA 試劑和加樣板，采用間接免疫熒光法。陰性對照選擇自身抗體陰性（人源），陽性對照選擇抗血小板抗體IgG陽性（人源）。②方法：取患者1.2～2.0 mL 乙二胺四乙酸抗凝血，離心處理并分離富血小板血漿，磷酸鹽緩沖液、吐溫緩沖液按1∶10 稀釋血漿，并取出30 μl 血漿加入樣板反應區，封蓋在18～25 ℃下溫育（期間需滴入25 μl 異硫氰酸熒光素標記的抗人球蛋白）30 min，避光操作，沖洗反應膜片，浸泡5 min，用吸水紙吸干載片水分，與二抗相應區域完全接觸，再次重復溫育-浸泡-吸水等操作，蓋玻片嵌入載片。最后顯微鏡下觀察熒光強度，并比較陰、陽性結果。

1.4 觀察指標

①統計ITP 組、正常組MK 計數及形態分類情況。形態分類包含原幼型、顆粒型、產板型、裸核型。②符合短期有效率評定標準[11]，包括完全反應、有效、激素依賴和無效。完全反應：沒有出血，治療后PLT 計數≥100×109/L；有效：沒有出血，治療后PLT 計數≥30×109/L，提升2 倍基礎PLT 數量；激素依賴：防止出血，持續用藥使PLT 計數≥30×109/L；無效：發生出血，治療后PLT 計數<30×109/L 或未能提升2 倍基礎PLT 數量。療效評估需測定2 次，且應間隔7 d 以上。

1.5 統計方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件處理數據，符合正態分布的計量資料用（）表示，組間差異比較采用t檢驗；計數資料用頻數和百分比（%）表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組MK 分類結果對比

ITP 組原幼型及顆粒型MK 計數均高于正常組，產板型MK 計數低于正常組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 兩組MK 分類結果對比[()，個/1.5×3.0 cm]

表1 兩組MK 分類結果對比[()，個/1.5×3.0 cm]

2.2 兩組MK 定量積分結果對比

ITP 組胞漿量、退行性變量高于正常組，顆粒量（伴有成熟障礙）低于正常組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 兩組MK 定量積分結果對比 [()，個/1.5×3.0 cm]

表2 兩組MK 定量積分結果對比 [()，個/1.5×3.0 cm]

2.3 MK 形態學診斷價值分析

顆粒型MK 敏感度、特異度為96.30%、60.00%，AUC 面積為0.913；原幼型MK 敏感度、特異度為94.74%、60.00%，AUC 面積為0.908；產板型MK 敏感度、特異度為94.34%、63.64%，AUC 面積為0.902；顆粒量敏感度、特異度為91.07%、62.50%，AUC 面積為0.893；退行性變量敏感度、特異度為88.89%、57.14%，AUC 面積為0.862；細胞漿量敏感度、特異度為88.67%、60.00%，AUC 面積為0.858。MK 形態學診斷ITP 的ROC 曲線，見圖1。

圖1 MK 形態學診斷ITP 的ROC 曲線

2.4 ITP 患者不同HPA 的短期有效率對比

HPA>1∶10 組短期有效率（100.00%）高于<1∶10組（90.00%）、1∶10 組（89.29%），差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 ITP 患者不同HPA 的短期有效率對比

3 討論

ITP 屬于自身免疫性疾病，因ITP 患者MK 常處于增多并伴有成熟障礙情況，故巨核細胞形態學變化是診斷ITP 的重要指標之一[12]。

本研究中ITP 組原幼型巨核細胞MK 計數（12.15±1.30）個/1.5×3.0 cm 高于正常組，顆粒型MK計數（69.78±14.07）個/1.5×3.0 cm 高于正常組，產板型MK 計數（9.70±7.15）個/1.5×3.0 cm 低于正常組（P<0.001）。ITP 組胞漿量（2.39±0.52）個/1.5×3.0 cm高于正常組，退行性變量（1.42±0.43）個/1.5×3.0 cm高于正常組，顆粒量（伴有成熟障礙）（1.88±0.17）個/1.5×3.0 cm 低于正常組（P<0.001）。顆粒型MK、原幼型MK、產板型MK、顆粒量、退行性變量、細胞漿量的AUC 面積分別為0.913、0.908、0.902、0.893、0.862、0.858。說明通過MK 形態學變化診斷ITP 具有重要意義。ITP 患者MK 計數、胞漿量及退行性變量明顯增加，顆粒量減少并伴有成熟障礙，主要因祖細胞受淋巴細胞產生的白介素和單核-巨噬細胞集落刺激因子（M-CFS）等活性物質的調控作用。加之自身抗體介導增加PLT 破壞，使巨核細胞出現生長、成熟障礙，致使PLT 計數降低。周紅琳等[13]研究中PITP 組原幼型MK 計數（44.13±59.79）個/1.5×3.0 cm、顆粒型MK 計數（48.84±85.26）個/1.5×3.0 cm 均高于正常組（5.78±1.00）、（53.49±10.77）個/1.5×3.0 cm，產板型MK計數（3.52±6.48）個/1.5×3.0 cm低于正常組（36.87±11.25）個/1.5×3.0 cm（P<0.05），裸核型（9.62±11.06）個/1.5×3.0 cm 與正常組（10.76±4.17）個/1.5×3.0 cm 差異無統計學意義（P>0.05），且伴有巨核細胞成熟障礙。說明巨核細胞可診斷不同類型的ITP。

本研究中HPA>1∶10 組短期有效率（100.00%）高于HPA<1∶10 組（90.00%）、1∶10 組（89.29%）（P<0.05）。說明HPA 陽性率高的患者經艾曲波帕治療后，治療效果良好。因艾曲波帕是口服TPO 受體激動劑[14]，與血小板生成素受體（MPL）跨膜區H499殘基結合，加速MK 增殖分裂，產生并釋放大量功能正常的血小板至外周循環[15-16]。諸多臨床試驗反應率高達80%左右，且未出現明顯的不良反應，適宜長期應用。黃月婷[17]使用艾曲波帕治療75 例成人ITP 患者，起始劑量分別為25 mg/d、50 mg/d、后續根據PLT 水平增至75 mg/d，治療后首次PLT≥30×109/L的中位時間是14 d，54.67%患者在14 d內起效。說明艾曲波帕起效快。治療總有效率為81.33%，32.00%的患者持續用藥≥6 個月仍有效，其中10 例患者停藥后≥6個月PLT仍維持>30×109/L。說明艾曲波帕持續用藥效果更佳。50 mg/d 或75 mg/d 組療效均高于25 mg/d，既往TPO 用藥史、血小板抗體表達、巨核細胞數不影響藥物療效。多數患者停藥后PLT 維持時間較短。說明既往用藥史不影響艾曲波帕治療效果，但需考慮長期用藥以維持PLT 水平。González-López TJ 等[18]給予老年ITP 患者艾曲泊帕治療，治療總緩解率為82%，治療3 個月及6 個月時的總緩解率分別為72%及61%，安全性較高。綜合各項研究表明艾曲波帕起效快，HPA>1：10 患者的治療效果更佳，同時不受用藥史及治療史影響，安全性高，但需長期用藥提高治療效果。

綜上所述，骨髓巨核細胞形態學變化可有效診斷ITP，ITP 患者服用艾曲波帕治療后，促進巨核細胞增殖、成熟，增加血小板計數，且HPA>1：10 患者的療效更佳。本研究樣本量較少，且未進行不同治療方式對比，未來可增加樣本量、不同治療方式的療效進行對比，為正確診療ITP 及預后效果提供參考依據。