有機磷農藥適配體-磁分離熒光檢測方法的建立及應用

胡超瓊，王力均,2，陶 璇,3，朱 云，梁 煜，楊 瀟，陳祥貴,2，黃玉坤,2,*

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039；2.宜賓西華大學研究院，食品非熱加工重點實驗室， 食品非熱加工工程技術研究中心，四川 宜賓 644004；3.成都倍特藥業股份有限公司，四川 成都 610041）

有機磷農藥多為磷酸酯類和硫代磷酸酯類化合物[1]， 具有高效、廣譜、易降解、易氧化、品種多、用途多樣、害蟲對其抗性發展緩慢等特點，在農業生產上得以廣泛使用。雖然有機磷農藥易分解，但在某些環境下，也存在較長的殘存周期，且多次小劑量接觸，會在生物體內發生蓄積，從而產生一系列神經中毒癥狀[2]。2007年我國已禁止甲胺磷、對硫磷、甲基對硫磷、久效磷、磷胺5種高毒有機磷農藥在國內的生產、銷售及農業上使用[3]。 由于人們使用不當、不遵循安全間隔期、環保意識淡薄等，導致有機磷農藥在環境和食品中殘留超標，對人體健康造成威脅。我國國家標準[4]規定了甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷在柑橘類水果中的最大殘留限量分別為0.01、0.02、0.2 mg/kg。

目前，有機磷農藥的檢測方法多為傳統儀器檢測法，包括高效液相色譜法[5]、氣相色譜法[6]、高效液相色譜-串聯質譜法[7]、氣相色譜-串聯質譜法[8]、超高效液相色譜-串聯質譜法[9]等。傳統儀器檢測法精確度高、靈敏度高、檢測范圍廣，但是存在操作過程繁雜、耗時、對儀器及工作人員要求較高等缺點，不適用于快速檢測大量樣品。還有一些快速檢測方法，如酶抑制法[10]、酶聯免疫吸附法[11]、生物傳感器法[12]等，但這些快速檢測方法的靈敏度有限、體系穩定性有待增強，且對甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷等有機磷農藥敏感性較差，應用范圍較窄。因此，建立高效、快速同時多種有機磷農藥殘留檢測方法對于食品安全具有重要意義。

核酸適配體是單鏈的DNA或RNA，由數十個堿基構成，通過卷曲折疊形成復雜的三維結構，具有類似于抗體的性質，能識別特定的分子，因此也被稱為“化學抗體”[13]。適配體具有特異性好、能夠體外合成、成本低、易修飾、可重復利用等特點[14]，在農藥檢測領域已有所涉及。劉媛媛等[15]在信號轉導元件納米金粒子表面修飾有機磷適配體，構建出用于檢測中藥材中甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷、水胺硫磷4種有機磷農藥的適配體傳感器，當4種有機磷殘留總量超過1 000 μg/L時，溶液體系產生肉眼可識別的顏色變化。陸婷婷等[16]基于利用核酸適配體調控熒光碳量子點熒光強度的原理構建了一種適配體熒光傳感器用于檢測農產品中的樂果。

納米磁珠是目前結合適配體構建傳感器的重要材料之一，具有低毒性、磁性好、易修飾等優點，在表面修飾聚吡咯材料具有更好的吸附能力[17]、催化性[18]及光感性能[19]等。Zhu Wanying等[20]在磁珠表面包覆聚吡咯（Fe3O4@PPy NPs）合成了核殼結構，利用其磁分離性能及對熒光猝滅能力構建傳感器檢測腺苷，該方法在0.5～500 nmol/L具有良好的線性關系，檢出限達0.15 nmol/L。因此，本實驗基于AptS4-29，在適配體5′端修飾熒光基團，采用溶劑熱法合成磁珠，并包裹聚吡咯形成納米材料，建立磁分離輔助熒光分析法檢測砂糖橘中甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷3種有機磷農藥，旨在為食用農產品中有機磷農藥的快速篩查提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

六水合氯化鐵（FeCl3·6H2O，分析純） 上海源葉生物有限公司；聚(4-苯乙烯磺酸-共聚-馬來酸)鈉鹽（poly(4-styrenesulfonic acid-co-maleic acid) sodium salt，PSSMA，生化級） 成都化夏化學試劑有限公司；戊二醛（分析純） 上海麥克林公司；聚吡咯（99%，色譜純）、敵瘟磷標準品（≥97.0%）、異稻瘟凈標準品（≥99.5%）（均為分析純） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；無水醋酸鈉（NaAc，分析純）、過硫酸銨 （分析純） 成都市科隆化學品有限公司；乙二醇（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；馬拉硫磷標準 品（≥98.0%）、甲拌磷標準品、丙溴磷標準品（均為分析純） 美國Sigma公司；氧化樂果標準品（96.6%，分析純） 德國Ehrenstorfer公司；滅多威標準品、抗蚜威標準品、克百威標準品（均為分析純） 沈陽國家農藥產品質量檢測中心。

6-羧基熒光素標記適配體S4-29 （6-carboxyfluorescein-labeled aptamer S4-29，FAM-AptS4-29）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，堿基序列為：5′-6-FAM- AAGCTTTTTTGACTGCAGGTGAAAAAGAG-3′（來自本課題組的前期研究）。

1.2 儀器與設備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司；UV2800紫外-可見分光光度計 上海天美天平儀器有限公司；真空干燥箱 上海博訊實業有限公司；spectraMax i3x多功能酶標儀 美國Molecular Devices 公司；Fluoromax-4熒光光譜儀 美國HORIBA集團 公司；透射電子顯微鏡 日本JE-OL公司；傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀 德國布魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 Fe3O4納米粒子（nanoparticles，NPs）的合成

采用溶劑熱法制備納米磁珠Fe3O4，參考Dong Yixiao等[21]的方法。向100 mL圓底燒瓶中依次加入40 mL乙二醇、1.08 g FeCl3·6H2O、3.0 g NaAc和1.0 g PSSMA。將燒瓶置于50 ℃攪拌均勻，加入0.6 g NaOH繼續攪拌至溶液變成暗黑透明狀。將溶液轉移到干燥的聚四氟乙烯反應釜中，190 ℃加熱9 h后自然冷卻至室溫。將產物轉移至燒杯中，棄去上層液體，用乙醇-水（1∶1，V/V）溶液和去離子水交替清洗固體產物3 次，50 ℃真空干燥過夜。固體顆粒研磨后于室溫封閉保存。

1.3.2 Fe3O4@PPy NPs合成

參考Zhu Wanying等[20]的方法制備Fe3O4@PPy NPs。將20 mg Fe3O4NPs分散于12 mL水中，接著加入30 μL吡咯攪拌30 min。加入3 mL 0.14 mol/L過硫酸銨溶液混合均勻后，4 ℃孵育4 h。用外加磁場分離獲得Fe3O4@PPy NPs，按乙醇、去離子水的順序清洗，50 ℃真空干燥，固體顆粒研磨后室溫封閉保存。

1.3.3 磁分離輔助熒光分析法的建立

將50 μL 0.2 mg/mL Fe3O4@PPy NPs加入至50 μL 100 nmol/L的FAM-AptS4-29溶液中，室溫孵育20 min，使熒光猝滅，3 次洗滌后磁分離去除游離適配體，將FAM-AptS4-29與Fe3O4@PPy NPs復合物復溶于結合緩沖液（50 mmol/L Tris、50 mmol/L NaCl、10 mmol/L KCl、10 mmol/L MgCl2，pH 8.0）中。加入50 μL濃度為0.001、0.01、0.1、1、10、100 nmol/L的丙溴磷、甲拌磷、氧化樂果，室溫振蕩孵育120 min。最后，通過磁分離得到上清液。通過計算相對熒光強度（（F2-F1）/F1）評估輸出信號，其中F2和F1分別表示在有和無靶標磁分離后所測定的熒光強度。用酶標儀在激發波長485 nm，發射波長535 nm條件下測定熒光強度。

1.3.4 磁分離輔助熒光分析法的選擇性評價

選擇6種常見的農藥作為干擾物質，其中包括3種有機磷農藥（馬拉硫磷、敵瘟磷、異稻瘟凈）和3種氨基甲酸酯類農藥（滅多威、抗蚜威、克百威），濃度均為1 nmol/L。采用上述檢測方法進行選擇性評價分析。

1.3.5 樣品回收率和精密度實驗

將去皮后的砂糖橘樣品在勻漿機中高速勻漿2 min，準確量取5 g于離心管中，加入10 mL丙酮混勻后振蕩30 min，10 000 r/min離心10 min，保留上清液并定容至15 mL，混勻后，采用0.45 μm濾頭過濾，濾液作為待測樣品溶液。同時，將不同濃度的丙溴磷、甲拌磷、氧化樂果標準溶液分別添加到5 mL勻漿中，采用上述前處理步驟制成樣品液。對每個樣品進行3個不同水平添加，每個水平重復3 次進行回收實驗，并計算回收率，采用相對標準偏差考察精密度。

1.4 數據統計與圖表繪制

采用Origin 2019軟件進行數據統計及作圖，每組實驗重復測定3 次，數據取平均值。

2 結果與分析

2.1 磁分離輔助熒光分析法的設計原理

采用溶劑熱法合成納米磁珠Fe3O4，再以PPy和過硫酸銨對制備的Fe3O4納米磁珠進行表面修飾后得到PPy包覆的核殼型Fe3O4@PPy NPs。原理如圖1所示，將 Fe3O4@PPy NPs與FAM-AptS4-29孵育，適配體與Fe3O4@PPy NPs通過π-π堆積作用吸附至Fe3O4@PPy NPs表面[22]，FAM熒光被猝滅，通過磁分離過程去除游離適配體，此時熒光強度最低。加入有機磷農藥之后，Fe3O4@PPy NPs表面的適配體優先與有機磷農藥結合，并被觸發打開結構，形成有機磷農藥-適配體復合物，抑制PPy吸附適配體。這種作用使Fe3O4@PPy NPs釋放FAM-AptS4-29， FAM-AptS4-29的熒光強度得到恢復。

圖1 磁分離輔助熒光分析法原理示意圖Fig. 1 Schematic illustration of magnetic separation assisted fluorescence analysis

2.2 Fe3O4@PPy NPs的表征

2.2.1 FTIR表征

由圖2可知，577 cm-1處為鐵氧鍵（Fe—O）的振動吸收峰[23]。在Fe3O4@PPy NPs的FTIR中，1 557 cm-1為吡咯環的拉伸振動峰[24]，1 189、1 046 cm-1和928 cm-1處的其他峰是由面內和面外的C—H和N—H彎曲振動引起[25]。所有這些峰都表明PPy在Fe3O4@PPy NPs中的存在。磁珠表面包裹聚吡咯后，鐵氧鍵（Fe—O）的振動吸收峰發生偏移，從577 cm-1變為621 cm-1，也證實了Fe3O4NPs的存在以及Fe3O4NPs與PPy的強烈結合，而不是2種組分的混合，進一步表明了在Fe3O4NPs表面成功包被PPy，成功制備出了核殼型Fe3O4@PPy NPs。

圖2 Fe3O4@PPy NPs的FTIR圖Fig. 2 FTIR spectrum of Fe3O4@PPy NPs

2.2.2 透射電鏡表征

采用透射電子顯微鏡對制備的Fe3O4@PPy NPs的形貌進行了表征。由圖3可知，Fe3O4@PPy NPs的粒徑約為100 nm以內，形狀類似球形，且具有明顯的核殼結構。說明納米磁珠表面成功包被聚吡咯，Fe3O4@PPy NPs制備成功。

圖3 Fe3O4@PPy NPs的透射電鏡圖Fig. 3 Transmission electron microscopic images of Fe3O4@PPy NPs

2.2.3 分散性及磁性能表征

由圖4可知，Fe3O4@PPy NPs在水中能夠均一穩定地分散，當有外加磁場存在時，Fe3O4@PPy NPs能夠快速響應并向磁鐵方向聚集，表明Fe3O4NPs表面包覆聚吡咯后依然保持較強的磁性能。

圖4 Fe3O4@PPy NPs在去離子水中的分散穩定性（A）和 與在外加磁場下的磁響應（B）直觀圖Fig. 4 Dispersion stability of Fe3O4@PPy NPs in deionized water (A) and magnetic response to applied magnetic field (B)

2.2.4 紫外-可見吸收光譜表征

FAM在485 nm波長處受到激發后在535 nm左右具有最高的熒光發射強度。從圖5可以看出，Fe3O4@PPy NPs在該波長掃描范圍內都具有光吸收特性，能夠與FAM基團發生熒光共振能量轉移，進而引起熒光猝滅。因此，Fe3O4@PPy NPs可用作本實驗的熒光猝滅分子。

圖5 Fe3O4@PPy NPs的紫外-可見吸收光譜圖Fig. 5 UV-visible spectrum of Fe3O4@PPy NPs

2.3 磁分離輔助熒光分析法條件優化

2.3.1 Fe3O4@PPy NPs合成質量比的優化

由于PPy與FAM-AptS4-29相互作用強，熒光猝滅能力強，穩定性及水溶性好，磁選方便，因此選擇Fe3O4@PPy NPs作為猝滅劑。PPy具有一定的吸附作用，含量過多會導致靶標加入后熒光強度不易恢復。因此，Fe3O4NPs與PPy在合成時的質量比在熒光猝滅與恢復過程中有重要影響，需要優化Fe3O4@PPy NPs合成時的質量比。Fe3O4NPs和PPy質量比分別為1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5，優化結果如圖6B所示，當PPy質量占比增大時，相對熒光強度先增大后減小，且甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷3 組之間的變化趨勢無顯著差異。由圖6B可知，Fe3O4@PPy NPs在不同合成比時，均具有較好的猝滅效果。因此，當相對熒光強度（（F2-F1）/F1）達到最大值時，選擇Fe3O4NPs和PPy的最佳質量比1∶1.5。

圖6 Fe3O4 NPs與PPy質量比對熒光猝滅信號（A）和 熒光信號（B）的影響Fig. 6 Effect of Fe3O4 NPs/PPy mass ratio on fluorescence quenching signal (A) and fluorescence signal (B)

2.3.2 猝滅劑Fe3O4@PPy NPs濃度的優化

Fe3O4@PPy NPs不僅作為熒光FAM基團的猝滅劑，而且還具有磁分離作用，2 次磁分離有效降低了背景熒光的干擾，提高了檢測體系的靈敏度。采用優化條件相同的熒光生物探針的濃度，控制不同Fe3O4@PPy NPs質量濃度，測定猝滅前后的熒光強度F0與F1。由圖7可知，隨著Fe3O4@PPy NPs質量濃度不斷增大，熒光猝滅現象越明顯。當質量濃度增大至0.2 mg/mL后，熒光猝滅現象變化不明顯，說明熒光猝滅效率已經達到較高水平，所以實驗選擇0.2 mg/mL作為Fe3O4@PPy NPs的最佳質量濃度。

圖7 Fe3O4@PPy NPs質量濃度對熒光信號的影響Fig. 7 Effect of Fe3O4@PPy NPs concentration on fluorescence signal

2.3.3 加入靶標后孵育時間的優化

為考察孵育時間對熒光信號的影響，調整孵育時間為30、60、90、120、150、180 min。每組平行測定3 次。如圖8所示，甲拌磷和氧化樂果在90～150 min范圍內，熒光信號隨孵育時間的延長顯著增強，丙溴磷的熒光信號在第90分鐘最強，隨后減弱。因此，為保證3種靶標物質的反應液的熒光信號都維持在較高水平，選擇孵育時間為120 min。

圖8 孵育時間對熒光信號的影響Fig. 8 Effect of incubation time on fluorescence signal

2.4 磁分離輔助熒光分析法的標準曲線

甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷的濃度與（F2-F1）/F1在1.00×10-4～1.00×102μg/kg范圍內呈良好的線性關系，線性回歸方程分別為y＝0.076 34x+0.399 24，y＝0.043 91x+0.390 27，y＝0.050 02x+0.298 98，相關系數R2分別為0.994 4、0.988 8和0.981 8；檢出限分別為4.17×10-4、2.77×10-4、4.67×10-4μg/kg（RSN＝3）。如表1所示，與現有7種有機磷農藥的檢測方法相比較，本實驗具有較寬的線性范圍及較高的靈敏度，表明該檢測方法具有優越性。

表1 有機磷農藥檢測方法的比較Table 1 Comparison of different detection methods for OPPs

2.5 選擇性分析

由圖9可知，該檢測方法與其他3種有機磷農藥和3種氨基甲酸酯類農藥之間差異顯著（P＜0.05），無明顯交叉反應，表明該方法選擇性強。

圖9 磁分離輔助熒光分析法的選擇性評價Fig. 9 Selectivity evaluation of magnetic separation assisted fluorescence analysis

2.6 樣品回收率和精密度實驗結果

通過向砂糖橘樣品中分別加入甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷的標準溶液，使得甲拌磷添加量為2.60×10-3、 0.260、9.113 μg/kg，氧化樂果添加量為2.13×10-3、0.213、14.937 μg/kg，丙溴磷添加量為3.74×10-3、0.374、37.363 μg/kg，采用本實驗方法進行檢測，平行測定3 次，計算樣品的加標回收率。如表2所示，本方法的加標回收率在79.94%～108.00%之間，相對標準偏差在3.05%～7.39%之間，表明該方法具有良好的準確度。

表2 加標回收率（n=3）Table 2 Recoveries of OPPs in spiked samples (n = 3)

3 結 論

本實驗建立了甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷3種有機磷農藥的磁分離輔助熒光分析方法。通過實驗優化參數，得到優化實驗條件為Fe3O4NPs與PPy質量比1∶1.5、猝滅劑Fe3O4@PPy NPs最佳質量濃度0.2 mg/mL、孵育時間120 min，甲拌磷、氧化樂果、丙溴磷3種農藥的檢出限分別為4.17×10-4、2.77×10-4、4.67×10-4μg/kg，在1.00×10-4～1.00×102μg/kg范圍內具有良好的線性關系，在砂糖橘中的添加回收率在79.94%～108.00%之間，具有較好的靈敏度和精密度。該法采用的適配體是AptS4-29， 在5′端修飾熒光基團FAM，Fe3O4@PPy NPs作為熒光猝滅劑，同時利用其磁性進行了2 次磁分離過程，提高了靈敏度，為食品中有機磷農藥分析提供了有效手段。