柱切換法液相色譜測定保健食品中的VA、VD、VE

張麗媛，戚綠葉，周明昊

（浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 310052）

維生素是人體代謝中必不可少的有機化合物，是維持人體健康所必須的物質。這種物質在人體內不能合成或合成量太少，雖然需要量很少，但必須由食物供給[1]。保健食品是一種具有特定保健功能或者以補充維生素、礦物質為目的的食品，適宜于特定人群食用，具有調節機體功能的作用[2]。維生素類保健食品具有廣泛的市場。VA又稱視黃醇，能夠促進骨骼生長，維持正常視力，缺乏可導致生長發育緩慢，干眼癥等癥狀[3]。VD是一組具有抗佝僂病作用，結構類似的固醇類衍生物的總稱，具有調節鈣、磷代謝，促進骨骼發育的作用。最主要的是VD2（麥角鈣化醇）和VD3（膽鈣化醇）[4-6]。VA和VD都是脂溶性維生素，通常在食物中共存，主要存在于動物肝臟、蛋類、魚肝油中。VA和VD在人體發育特別是對嬰幼兒視力、生殖器官、骨骼、牙齒發育中的重要作用，促進了一系列維生素AD類保健食品的上市。VE又稱生育酚，是重要的抗氧化劑，具有促生育、抗衰老，提高抵抗力的作用。生育酚主要有4種衍生物，按甲基位置分為α-、β-、γ-和δ-生育酚[7]。其中α-生育酚在自然界中分布最廣泛，含量最豐富[8]。

目前，分離VE異構體的方法有薄層色譜法、氣相色譜法和基于正相色譜的液相色譜法[9-12]。VD的測定方法有液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法、超臨界流體色譜法、放射免疫與薄層色譜法等[13-15]。應用較廣泛的為正相色譜凈化、分離、反相色譜定量檢測的液相色譜法。目前，對于VA、VD、VE類產品含量測定的研究，主要集中在嬰幼兒配方乳粉以及配方飼料或中藥方面[16-20]，對于保健食品領域研究較少。保健食品中VA、VD、VE的測定主要依據GB 5009.82—2016《食品中維生素A、D、E的測定》。其中，VA、VE主要采用第一法，皂化萃取后用反相色譜定量檢測；VD主要采用第四法，由于含量低，基質干擾嚴重，需采用正相色譜凈化、分離、收集，反相色譜定量檢測。同時測定VA、VD、VE需采用兩個方法，兩次前處理，兩套液相色譜，對儀器、人員要求較高。整個實驗過程繁瑣復雜，多次轉移復溶，且VA、VD、VE對光、熱、氧氣等較敏感，影響測定結果。

二維液相色譜基于其良好的分離效果，已廣泛用于復雜基質樣品中目標組分或全組分的分析[17]。二維液相色譜采用色譜柱串聯技術，將樣品凈化、分離、收集、測定過程連續自動進行。樣品經過一維色譜柱的初步分離，通過閥切換使其中一種或多種目標組分進入二維色譜柱中進一步分離，從而實現在復雜基質中排除干擾物質的在線凈化分析過程[21-22]。隨著二維液相色譜的發展普及，用于檢測VA、VD、VE的文獻也時有報道[11,16,19-25]。檢測方法為，樣品通過第一維色譜柱分離VA和VE，同時對VD進行凈化，將初步凈化后的VD在線引入第二維色譜柱進行分離測定，整個過程只需一次進樣，便可完成樣品中VA、VD、VE的測定，減少了前處理過程，提高了實驗效率。但是，由于VE四個異構體及VD2、VD3分離難度大，目前，文獻報道的多為同時檢測VA、VD2、VD3、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚中的其中幾個，沒有同時檢測7種組分的方法。本實驗基于GB 5009.82—2016樣品前處理方法，建立一種高效、準確同時測定保健食品中7種VA、VD、VE組分的二維反相高效液相色譜法，以期為保健品中多種維生素同時檢測提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

視黃醇（純度95%）、γ-生育酚（純度96%）、δ-生育酚（純度90%） 美國Sigma公司；α-生育酚（純度100%） 美國Supelco公司；β-生育酚（純度98%） 百靈威科技有限公司；VD2（純度99.9%）、VD3（純度99%） 中國食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Meker公司；無水乙醇、氫氧化鉀、2,6-二叔丁基對甲酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）、抗壞血酸、石油醚（30～60 ℃）、乙醚（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜系統（配有雙四元泵、自動進樣器、柱溫箱內置兩位六通閥、2個二極管陣列檢測器和Open LAB CDS數據處理系統） 美國安捷倫公司；XPE 205電子天平 瑞士梅特勒公司；Hei-VAP旋轉蒸 發儀 德國Heidolph公司；Genpure超純水儀 美國熱電公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

采用中心切割的柱切換法對保健食品中VA、VD、VE進行分析，該分析過程包含3個階段：第1階段（0～5.35 min）為進樣、檢測VA，此時閥的位置為1-2；第2階段（5.35～5.80 min）為凈化、捕獲VD，此時閥的位置為1-6；第3階段（5.80～15.0 min）為第一維繼續檢測4種VE，第二維檢測VD，此時閥的位置為1-2。系統流路見圖1。

圖1 二維柱切換流路系統示意圖Fig. 1 Schematic diagram of two-dimensional column switching system

一維色譜柱：Agilent Poroshell 120 PFP（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；二維色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse PAH（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；捕獲柱：Agilent Poroshell 120 EC C18（4.6 mm×5 mm，4 μm）；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；檢測波長：一維檢測器325 nm和294 nm，二維檢測器264 nm；一維流速：1.0 mL/min，二維流速：0.3 mL/min。流動相梯度洗脫見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.3.2 對照品溶液的配制

分別稱取視黃醇、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚、VD2和VD3對照品各20 mg，于10 mL棕色容量瓶中，加無水乙醇溶解并定容至刻度，得對照品單標儲備溶液。使用時用甲醇配制成系列標準混合溶液。

1.3.3 供試品溶液制備及測定

參照GB 5009.82—2016中有關樣品前處理方法，樣品先經過熱皂化，皂化液經石油醚-乙醚 （1∶1，V/V）混合液萃取，石油醚-乙醚混合萃取液經過無水硫酸鈉脫水后低溫減壓回收溶劑，再以甲醇溶解殘留物并定容后，上機分析。本法使用的所有器皿不得含有氧化性物質；分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油；處理過程應避免紫外光照，盡可能避光操作；提取過程應在通風柜中操作。具體操作如下：

稱取2 g樣品經均質后于150 mL平底燒瓶中，加入20～30 mL溫水（40～50 ℃），1.0 g抗壞血酸和0.1 g BHT，混勻。加入30 mL無水乙醇，加入10～20 mL質量濃度為50 g/100 mL的氫氧化鉀溶液，邊加邊振搖，混勻后于恒溫振蕩器上80 ℃皂化30 min，皂化后立即用冷水冷卻至室溫。一般皂化時間為30 min，如皂化液冷卻后，液面有浮油，需要加入適量上述氫氧化鉀與無水乙醇溶液，并適當延長皂化時間。將皂化液用30 mL水轉入250 mL的分液漏斗中，加入50 mL石油醚-乙醚混合溶液振蕩萃取5 min，將下層溶液轉移至另一250 mL的分液漏斗中，加入50 mL的石油醚-乙醚混合溶液再次萃取，合并醚層。用約150 mL水洗滌醚層，約需重復3 次，直至將醚層洗至中性（可用pH試紙檢測下層溶液pH值），去除下層水相。將洗滌后的醚層經無水硫酸鈉（約3 g）濾入250 mL旋轉蒸發瓶或氮氣濃縮管中，用約15 mL石油醚-乙醚混合溶液沖洗分液漏斗及無水硫酸鈉2 次，并入蒸發瓶內，并將其接在旋轉蒸發器或氣體濃縮儀上，于40 ℃水浴中減壓蒸餾或氣流濃縮，待瓶中醚剩下約2 mL時，取下蒸發瓶，立即用氮氣吹至近干，用甲醇分次轉移到容量瓶中，并定容至刻度。溶液過0.22 μm有機系濾膜后上機測定。定容體積視待測物目標濃度而定，處在線性范圍內進行定量。分別精密吸取對照品溶液10 μL與供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀 進行測定。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的選擇

一維色譜柱的選擇主要依據其對VA與4種生育酚的分離效果。其中，4種生育酚的分離較難，特別是β-生育酚和γ-生育酚的分離對色譜柱要求較高。作為異構體的4種生育酚，普通C18柱達不到較好的分離效果。國標方法GB 5009.82—2016第一法選擇C30柱分離含有4種生育酚的保健食品，且溫度控制在（20±2）℃，條件較為嚴格，分析時間較長。Agilent Poroshell 120 PFP柱為五氟苯基柱，可用于鹵代化合物的位置異構體和非鹵代化合物的選擇性分析，如含羥基、羧基、硝基和其他極性基團的極性化合物。且當官能團處于芳香或其他剛性環狀系統上時，色譜柱選擇性會增強[26]。生育酚是色滿（苯并二氫呋喃）的衍生物，由一個具有氧化活性的6-羥色環和一個類異戊二烯側鏈構成。根據苯環上甲基數及位置的不同分為α-、β-、γ-和δ-生育酚（圖2）[27]。因此，4種生育酚可以在Agilent Poroshell 120 PFP柱上得到有效分離。

圖2 生育酚的化學結構式Fig. 2 Structural formula of vitamin E

二維色譜柱的選擇主要依據其對VD2和VD3的分離效果。Agilent Zorbax Eclipse PAH多環芳烴柱采用聚合C18鍵合填料填充，能夠為多環芳烴的分離提供高選擇性。其還可以用于需要空間選擇性的鍵合相或不同鍵合方式的C18柱以實現分離的化合物。VD2和VD3是兩種同效的維生素，其結構來源于類固醇的環戊氫烯菲環結構[28]。VD2和VD3只是側鏈結構的不同，前者較后者在側鏈上多了1個雙鍵和1個甲基[29]。因此，VD2和VD3可以在Agilent Zorbax Eclipse PAH柱上得到有效分離。

二維液相色譜條件選擇需考慮色譜柱的差異性和流動相的兼容性[12]。Agilent Poroshell 120 PFP （4.6 mm×100 mm，2.7 μm）柱和Agilent Zorbax Eclipse PAH（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）柱良好的正交性和流動相的相容性，確保了4種生育酚的有效分離及VD2和VD3的準確定量（圖3）。

圖3 VD的化學結構式Fig. 3 Structural formula of vitamin D

2.2 閥切換時間的確定

采用在線柱切換二維色譜法分離樣品中的VA、VD、VE。樣品進樣后通過一維色譜柱進行初步分離，通過閥切換將含有VD2和VD3的餾分切割至捕獲柱，捕獲柱與二維色譜柱串聯，由二維色譜柱進一步分離VD2和VD3，一維色譜柱繼續分離4種生育酚，一維檢測器檢測VA與生育酚。二維檢測器檢測VD2和VD3。閥切換圖見圖1。為確定閥的準確切換時間，減少溶劑效應和提高回收率，需要確定VD2和VD3出峰時間的起點和終點。通過關閉閥切換命令在一維色譜柱與一維檢測器上進行標準品分析，測定VD2和VD3的出峰時間起點和終點。由于使用捕獲柱收集一維色譜柱的VD2和VD3的餾分，而捕獲柱柱容量小，需要考慮在閥切換的時間段內捕獲柱是否能完全將VD2和VD3收集[16]。因此，需要在一維色譜柱上盡量減小VD2和VD3的分離度，縮短峰寬。通過多次實驗確定，Agilent Poroshell 120 PFP（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）為一維色譜柱，流速為1.0 mL/min，由標準品測試確定出閥切換時間為5.35 min，更改閥的位置端口1-6，5.80 min更改閥的位置端口1-2。

2.3 取樣量的選擇

目前，食品中VA、VD、VE的測定主要依據GB 5009.82—2016，固體樣品取樣量為2～5 g或5～10 g，取樣量較大且不固定，這主要是因為食品種類繁多，劑型不固定，含量差距較大。保健食品相對食品有較固定的劑型，且保健食品主要是以補充營養物質為目的，而人體需要的維生素含量有一定的范圍，所以市售保健食品中維生素含量有較固定的范圍。本研究調研了國內幾大維生素生產企業市售VA、VD、VE類保健食品，結果顯示，VA、VD、VE類保健食品主要以片劑和膠囊劑為主，VA含量范圍為0.1～1.0 mg/g，VD含量范圍為0.69～17.2 μg/g，VE含量范圍為3.7～500 mg/g。其中，單方VE保健食品VE含量范圍為80～500 mg/g，復方VE保健食品VE含量范圍為3.7～26.2 mg/g。因保健食品樣品較均勻，且較大取樣量可能對提取效率產生影響，結合VD較低的含量，選擇2 g作為樣品取樣量，10 mL作為測定VD時的定容體積，VA、VE稀釋至線性范圍內進行定量。

2.4 提取溶劑的選擇

選擇石油醚-乙醚混合液萃取保健食品中VA、VD、VE。因乙醚為易制毒試劑，使用時受到嚴格管制，為方便實驗，考察只用石油醚的萃取效果。結果表明，石油醚提取只含有VA、VD和α-生育酚的保健食品時萃取效果與石油醚-乙醚混合液沒有顯著差異；萃取含有β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚3種生育酚的保健食品時，萃取效果不好，這是因為這3種生育酚較α-生育酚極性強，根據相似相溶原理，弱極性的石油醚對他們達不到較好的萃取效果。故在提取含有這3種生育酚的保健食品時必須用石油醚-乙醚混合液。

2.5 標準曲線與定量限測定

精密吸取各對照品單標儲備溶液，加甲醇配制成VA質量濃度為2.50、10.0、20.0、40.0、50.0 μg/mL，4種生育酚質量濃度為 5.00、20.0、40.0、80.0、100.0 μg/mL， VD2和VD3質量濃度為0.10、0.20、0.50、1.00、 2.00 μg/mL的標準系列混合溶液。分別吸取系列標準混合溶液各10 μL，依次注入液相色譜儀。以質量濃度（μg/mL） 為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算回歸方程。以10 倍信噪比確定定量限。結果（表2）表明：VA在2.50～50.0 μg/mL線性范圍內，4種生育酚在5.00～100.0 μg/mL線性范圍內，VD2和VD3在0.10～2.00 μg/mL線性范圍內，線性相關性良好。

表2 7種化合物的線性方程、相關系數和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients and limits of quantitation for seven vitamin compounds

2.6 精密度及系統適用性檢測

分別精密吸取VA質量濃度為50.0 μg/mL、4種生育酚質量濃度為100.0 μg/mL、VD2和VD3質量濃度為2.00 μg/mL的標準混合溶液10 μL，連續進樣6 次，記錄峰面積。相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于0.5%。各組分理論塔板數均大于10 000，分離度均大于1.5（表3）。表明儀器精密度良好，滿足系統適用性要求。標準混合溶液圖譜見圖4。

表3 精密度及系統適用性結果Table 3 Results of precision and system suitability

圖4 標準品二維液相色譜圖Fig. 4 Two-dimensional chromatogram of mixed vitamin standard solution

2.7 回收率與重復性實驗結果

采用陰性樣品加標回收法測定回收率。分別向陰性樣品中加入適量對照品溶液，按1.3.3節方法制備供試品溶液，使加標溶液質量濃度分別為VA：5.0、20.0、40.0 μg/mL；4種生育酚：10.0、40.0、80.0 μg/mL；VD2和VD3：0.20、0.80、1.60 μg/mL，分別作為低、中、高3個水平加標溶液。平行制備3 份樣，計算回收率，作為回收率樣品。中水平加標溶液平行制備6 份樣，作為重復性樣品，記錄峰面積，計算RSD。不同質量濃度水平平均回收率為89%～99%，RSD均小于4%。表明該方法準確度高、重復性好，結果見表4、5。

表4 樣品加標回收率及RSDTable 4 Recoveries and RSDs for spiked samples

表5 重復性結果Table 5 Results of repeatability

2.8 樣品測定結果

選取市售VA、VD、VE類保健食品，采用本法對樣品進行檢測。檢測結果發現，市售VD類保健食品中主要添加VD3，VE類保健食品中主要添加的為α-生育酚，所測樣品均符合各企業標準規定，結果見表6，某樣品圖譜見圖5。

表6 樣品測定結果Table 6 Results of vitamin determination in actual samples

圖5 樣品二維液相色譜圖Fig. 5 Two-dimensional chromatograms of samples

3 結 論

本實驗基于在線柱切換法二維液相色譜技術建立了保健食品中VA、VD、VE的測定方法，系統適用性實驗結果表明，本方法可滿足VA、VD、VE的測定要求，利用一維色譜柱可完成VA、4種生育酚的分離和VD的凈化，利用二維色譜柱可完成VD2、VD3的分離及定量分析。本方法的線性關系、準確度和精密度良好，采用優化的在線二維系統連接設計，一次進樣可完成VA、VD、VE的定量測定，大大提高了實際樣品的分析效率，可進行推廣應用。