QuEChERS技術結合超高效液相-串聯質譜同時測定薄皮甜瓜中7種葫蘆素

王 琦，岳 寧，李曉慧，李敏潔，蘇 杭，李春梅，王懷松，付秋實，王 靜，金 芬,*

（1.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081；2.中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

甜瓜（Cucumis meloL.）是葫蘆科一年生蔓性草本植物，是全球最重要的園藝作物之一。甜瓜以果實甘甜而著稱，香氣濃郁、風味獨特，含有蛋白質、碳水化合物、維生素等多種營養素，在我國果蔬生產和消費中占據重要地位[1-2]。據聯合國糧食及農業組織數據庫顯示，2018年全球甜瓜面積為104.73萬 hm2，產量達 2 734.92萬 t，分別占世界水果面積和產量的1.54%及3.15%[3]。中國作為全球甜瓜最大的生產和消費區，其產量約占世界甜瓜產量的一半（48%）[4-5]。目前，甜瓜已成為我國帶動農民增收的高效園藝作物和主要時令水果，其產業重要性日益提高[6]。

葫蘆素是甜瓜中苦味物質的主要成分之一，是一類高度氧化的四環三萜化合物[7-8]。葫蘆素在甜瓜的抗蟲、抵抗逆境過程中發揮了重要作用；同時還具有抗炎、抗腫瘤等多種生物活性，具有潛在的藥用價值。葫蘆素B是甜瓜中葫蘆素的主要成分，其抗腫瘤活性更強[9-12]?，F有葫蘆素的檢測方法多為高效液相色譜法，檢測種類少、時間長、靈敏度低、基質干擾重，同時對甜瓜中其他微量葫蘆素的組成和含量的研究少[13-14]；而液相色譜-串聯質譜法因其靈敏度高、特異性強，成為目前測定葫蘆素物質的首選檢測方法。然而，已有的液相色譜-串聯質譜法更多的關注葫蘆素B、E等在大鼠血液中的藥代動力學分布，而對含量較低、活性較高的葫蘆素沒有可用的檢測方法，缺乏綜合整體評價[12,14-19]。

QuEChERS法作為一種簡便、快速、安全、價格低廉的分析方法，已成功用于果蔬中農藥殘留的分析。近年來該方法在天然有機物提取及分析中的應用越來越多，特別是在活性物質的提取和分析，如堅果中的生育酚及甾醇、五味子中木脂素成分[20-21]。為更準確地表征甜瓜中葫蘆素的種類及含量分布，本研究利用高效液相色譜-串聯質譜技術結合分散固相萃取前處理方法，建立同時測定甜瓜中7種主要葫蘆素的檢測方法，并對不同成熟期甜瓜中的葫蘆素含量進行分析。該方法穩定、靈敏度高、分析周期短，可為甜瓜中葫蘆素活性成分的提取及分析提供有效的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薄皮甜瓜459由中國農業科學院蔬菜花卉研究所甜瓜課題組提供。

色譜級標準品：葫蘆素B（純度＞97%，CAS#6199-67-3），葫蘆素D（純度＞90%，CAS#3877-86-9），葫蘆素E（純度＞95%，CAS#18444-66-1），葫蘆素B 2-O-β-D-葡萄糖苷（純度＞92%，CAS#65247-27-0），葫蘆素IIA（純度＞98%，CAS#58546-34-2），葫蘆素I（純度＞98%，CAS#2222-7-3）和異葫蘆素B（純度＞95%，CAS#17278-28-3） 上海源葉生物技術有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA，50 μm）、十八烷基鍵合硅膠（C18，50 μm）分散固相萃取吸附劑、乙酸銨（色譜級） 美國Sigma-Aldrich 公司；氧化鋯包覆硅膠（Z-Sep，50 μm）、碳十八鍵合鋯膠（Z-Sep+，50 μm） 美國Supelco公司；甲酸（色 譜級） 美國Fisher公司；無水硫酸鎂、氯化鈉（均為分析純） 北京化工廠；0.22 μm有機系濾膜 天津博納艾杰爾公司；所有分離用有機溶劑均為國產色譜純；實驗用超純水由 Milli-Q Advantage A10系統制備。

1.2 儀器與設備

Nexera LC液相系統、LC-MS8060三重四極桿質譜（配有電噴霧離子源及LabSolutions數據處理系統） 日本島津公司；ME104分析天平 瑞士Mettler Toledo 公司；Vortex-Genie 2渦旋混勻器 美國Scientific Industries公司；Sorvall ST8R高速冷凍離心機 美國Thermo公司；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備液（1 mg/mL）配制：準確稱取7種葫蘆素標準物質各10.0 mg，用甲醇分別溶解定容至10.0 mL，于-18 ℃冷凍保存。

標準混合儲備溶液（10 μg/mL）配制：分別取標準儲備液1.0 mL混合，用甲醇定容至100 mL，于-18 ℃冷凍保存。

標準工作液配制：使用時將葫蘆素標準儲備液使用乙腈逐級稀釋成所需質量濃度標準工作液或混合標準工作液。

1.3.2 樣品前處理

選取未成熟期（授粉后25 d）及成熟期（授粉后34 d）甜瓜為實驗材料，隨機采摘代表性完整甜瓜果實8～12個，去蒂去籽后加入液氮粉碎，準確稱取5.00 g粉碎后甜瓜樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩3 min后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min；取1 mL上清液加入裝有50 mg PSA和50 mg C18的離心管中，充分渦旋振蕩2 min，5 000 r/min離心5 min后取上層清液過0.22 μm有機濾膜后，使用乙腈稀釋至合適濃度上機 檢測。

1.3.3 色譜條件

XBridge C18色譜柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；柱溫40 ℃；進樣量2 μL；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸加5 mmol/L乙酸銨溶液，流速為0.20 mL/min。梯度洗脫：0～2.0 min，30% A，70% B；2.0～5.0 min，由30%～60% A，70%～40% B，保持1 min；6.0～10.0 min，60%～100% A，40%～0% B，保持2 min；12.0～12.5 min，100%～30% A，0%～70% B，保持3.5 min，總分析時長16 min。

1.3.4 質譜條件

電噴霧離子源；正負離子切換模式；多反應監測模式；離子噴霧電壓4.0 kV；霧化氣為氮氣，流速 3.0 L/min；干燥氣為氮氣，流速10 L/min；碰撞氣為氬氣；脫溶劑管溫度250 ℃；加熱模塊溫度400 ℃。7種葫蘆素的檢測參數見表1。

表1 7種葫蘆素的的保留時間與質譜參數條件Table 1 Mass spectrometric parameters and retention times for seven cucurbitacin standards

2 結果與分析

2.1 質譜參數優化

本研究采用注射泵直接將標準溶液注入離子源的方式對7種葫蘆素質譜參數進行優化。分別將7種葫蘆素質量濃度為0.1 mg/L標準工作液以10 μL/min的流速將標準工作液注入離子源，離子源為電噴霧離子源。正負離子模式下7種葫蘆素的一級質譜圖如圖1所示，在正離子模式下，葫蘆素B 2-O-β-D-葡萄糖苷、葫蘆素IIA、葫蘆素B、異葫蘆素B和葫蘆素E在一級質譜中易形成 [M+Na]+離子，這與相關報道一致[18,22-23]，但由于 [M+Na]+離子并不穩定，在定量分析過程中離子化程度波動較大，從而可能引起較大的定量偏差；而當在流動相中添加5 mmol/L乙酸銨時，Na+被NH4+取代，形成更加穩定且響應較高的[M+NH4]+離子，響應強度較 [M+Na]+離子提高1.5～2.5 倍[23-24]。而在葫蘆素D與葫蘆素I的一級質譜圖中，[M+H]+和[M+HCOO]-離子峰響應較高（圖1f、g）。這可能與葫蘆素B 2-O-β-D-葡萄糖苷、葫蘆素IIA、葫蘆素B、異葫蘆素B和葫蘆素E五種葫蘆素結構均含有酯鍵相關，有研究表明結構中含有酯鍵的化合物在質譜電離過程中易形成[M+NH4]+離子[25]；而葫蘆素D與葫蘆素I在結構中不存在酯鍵，因此分別形成[M+H]+、[M+HCOO]-準分子離子峰[22,25]。最終優化的質譜條件如表1所示。

圖1 正負離子模式下的7種葫蘆素的一級質譜圖及結構式Fig. 1 Structural formulae and primary mass spectra of seven cucurbitacin standards

2.2 色譜條件優化

葫蘆素B和異葫蘆素B為同分異構體結構，由表1可知，在質譜上無法通過離子對對其進行區分，因此需要對色譜條件進行優化，實現色譜分離。本研究使用C18色譜柱對7種葫蘆素進行分離，7種葫蘆素都達到了基線分離，如圖2所示；此外，比較甲醇和乙腈作為流動相對7種葫蘆素的分離及響應，發現當使用乙腈為流動相時，7種葫蘆素響應較甲醇作為流動相時提高1.2～1.5 倍；當在流動相中添加甲酸后，葫蘆素D離子化程度更高，且靈敏度增加27%；乙酸銨的加入改善了葫蘆素B 2-O-β-D-葡萄糖苷、葫蘆素IIA、葫蘆素B、異葫蘆素B和葫蘆素E的峰形。綜合考慮靈敏度和色譜峰形等，最終確定采用乙腈和0.1%甲酸加5 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相進行梯度洗脫，在此條件下，7種葫蘆素的色譜峰峰形良好，基質干擾小。

圖2 7種葫蘆素標準溶液總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of seven cucurbitacin standards

2.3 前處理優化

本實驗比較優化了5種不同吸附劑（PSA、C18、GCB、Z-Sep、Z-Sep+）及不同含量的吸附劑組合的添加量。使用與甜瓜質地相似的蘋果作為空白基質，按照1.3.2節進行前處理，收集第1次離心上清液，使用上清液配制1 mL 7種葫蘆素標準液樣品溶液（0.1 mg/L），后續步驟按前處理步驟進行，分別計算其回收率，確定吸附劑種類及添加量。當分別使用100 mg Z-Sep、Z-Sep+時，結果如圖3a所示，Z-Sep及Z-Sep+兩種吸附劑對7種葫蘆素均有強烈吸附作用，回收率很低（分別低于9%和10%）；當使用GCB作為吸附劑時，7種葫蘆素回收率為17%～74%，這與目標化合物中含有苯環平面結構，導致與GCB形成了強吸附相關[26-27]；而當采用PSA和C18用作吸附劑時，7種目標葫蘆素的回收率分別為77%～103%和94%～111%，PSA對色素、有機酸、脂肪酸及糖等極性干擾物的去除效果好，C18可用于去除極性較小的化合物，基本可滿足凈化需求[28-29]。

為了進一步提高甜瓜樣品的凈化效率，采用PSA和C18組合對甜瓜中7種葫蘆素回收率的影響進行評價。如圖3b所示，當添加PSA和C18的含量分別為100 mg時，葫蘆素E和葫蘆素I的回收率受到嚴重影響，分別為62%和58%。而降低PSA和C18的含量，添加50 mg PSA和50 mg C18時，回收效果較好，7種葫蘆素的回收率為81%～113%。因此，綜合考慮回收凈化效果以及實驗成本，選擇在1 mL提取液中使用50 mg PSA和50 mg C18作為吸附劑，用以凈化甜瓜基質，降低基質效應。

圖3 葫蘆素在5種不同吸附劑（a）和不同使用量的組合吸附劑（b）中的添加回收率Fig. 3 Effects of five different sorbents, separately (a) and in combination (b), on recoveries of cucurbitacins

2.4 方法驗證

2.4.1 線性范圍和檢出限

在0.1～1 500 μg/L質量濃度范圍內配制7種葫蘆素的混合標準溶液，以目標物的峰面積（y）對其相應的質量濃度（x）分別繪制標準曲線，按3 倍信噪比得到目標化合物的檢出限，10 倍信噪比得到目標化合物的定量限，結果如表2所示，7種葫蘆素檢出限及定量限分別為0.16～4.33 μg/kg和0.27～13.11 μg/kg，線性相關系數均大于0.999，與文獻中報道的水平相當[22,30]。

表2 7種葫蘆素在甜瓜中的添加回收率及精密度Table 2 Spiked recoveries and precision for seven cucurbitacins

2.4.2 回收率和精密度

同時使用與甜瓜質地相似的蘋果作為空白基質進行加標回收實驗，按照1.3.2節樣品前處理方法制備樣品，平行實驗5 次，分別在20、100 μg/kg和500 μg/kg 3個水平進行添加7種葫蘆素的混合標準溶液，計算加標回收率和相對標準偏差，結果見表2。7種葫蘆素的加標回收率分在75.7%～118.3%之間，相對標準偏差在0.5%～13.6%之間，其日內及日間相對標準偏差分別小于6.8%、8.3%，能夠滿足日常檢測需求。

2.5 實際樣品的檢測結果

使用1.3.1節方法對不同成熟期的甜瓜進行處理，研究發現除異葫蘆素B外，其余6種葫蘆素在授粉后25 d及授粉后34 d甜瓜中都可被檢測到，且授粉后34 d甜瓜中葫蘆素總含量較高，為52.24 mg/kg，授粉后25 d甜瓜總葫蘆素含量為46.34 mg/kg（表3）。在不同成熟期甜瓜中，葫蘆素B 含量較高，占總含量的65.0%～65.5%；其次是葫蘆素B 2-O-β-D-葡萄糖苷，占總葫蘆素含量29.9%～31.7%；其余葫蘆素含量均相對較低，總占比不足總量5%。

表3 實際樣品中7種葫蘆素測定結果及稀釋倍數（n=4）Table 3 Results of determination of cucurbitacin contents in unripe and ripe melons and corresponding dilution folds (n = 4)

3 結 論

本實驗采用改良的QuEChERS方法結合超高效液相色譜-串聯質譜建立同時對甜瓜中7種葫蘆素的分析方法，對其質譜條件、色譜條件及提取條件進行優化，在一級質譜中根據7種葫蘆素不同結構性質選擇了響應較高的準分子離子峰；以乙腈和0.1%甲酸加5 mmol/L 乙酸銨溶液為流動相進行梯度洗脫；并優化選擇了50 mg PSA及50 mg C18作為吸附劑對甜瓜基質進行凈化，7種葫蘆素的檢出限及定量限分別為0.16～4.33 μg/kg和0.27～13.11 μg/kg，并使用該方法對不同成熟期甜瓜中的葫蘆素進行分析。結果表明，方法前處理簡便、靈敏度高、精密度好，可用于甜瓜中多種葫蘆素的同時檢測。