DNA提取前處理方法對薩拉米香腸中細菌種群結構的影響

姬慶龍，趙貴明，王 娉，趙勇勝，趙曉美，楊海榮，陳 穎

（中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176）

薩拉米香腸是以豬、牛肉等為原料，按照一定肥瘦比例，加入鹽、大蒜、胡椒、辣椒等香料調味，經菌種發酵后在特定條件下干燥制成的干發酵香腸。香腸切開后，橫斷面呈現漂亮的大理石紋理，有股獨特的香氣與酸味[1]，是意大利傳統美食，也是歐洲人必不可少的大宗食品，雖然目前在我國生產消費量相對較少，但其國內市場正在逐步擴大，已形成自己的消費群體[2-3]。

發酵香腸的風味不僅取決于原材料和調味料，更與其中的微生物密切相關，因此了解其中微生物群落結構是風味研究及安全質控的關鍵[4-5]。但是傳統方法依靠培養、分離、純化等一系列手段，對微生物具有一定選擇性，無法全面反映發酵過程中微生物的種群結構。高通量測序技術與傳統微生物群落研究相比，可對樣品中微生物進行大規模平行測序，能夠客觀反映樣品中群落構成和多樣性，在腸道微生物、土壤微生物、海洋微生物、食品微生物等不同類型的環境樣品中微生態研究中得到了應用。目前，該技術已用于奶制品[6-8]、茶葉[9-10]、肉制品[11-15]、醬[16]、腌菜[17-18]等發酵食品的菌群結構分析。盡管高通量測序技術在分析食品菌群結構中表現出一定的優勢，但DNA提取方法、樣品濃度、建庫方法、引物選擇、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）循環數、目標菌鳥嘌呤（guanine，G）和胞嘧啶（cytosine，C）含量、測序平臺等[19]都會影響最終測序結果。為保證結果的可靠性以及不同研究之間結果的可比性，需要建立統一標準化的高通量菌群分析實驗流程。其中，DNA提取方法的比較是近年來研究關注點之一[20-21]，而樣品前處理是DNA提取的第一步。

與糞便、土壤、海水等樣品不同，食品樣品的組成較為復雜且菌群分布并不均一。因此從食品樣品中提取細菌DNA時，通常需對樣品進行前處理，如剪碎混勻、富集濃縮等。但不同前處理方法對樣品中細菌種群結構產生的影響，國內外少有報道。目前，通常采用DNA的產量與純度評價前處理方法有效性[22-24]。但DNA產量與微生物多樣性之間沒有明顯關聯，DNA產量大并不表明前處理方法滿足要求，只有盡可能獲得整個樣品中所有的微生物基因組，才能真實地反映樣品中實際的菌群結構[25]。

為此，本研究采用3種不同前處理方法提取薩拉米香腸細菌DNA，采用MiSeq高通量測序技術對其細菌種群結構進行分析。通過比較3種方法提取的樣品中細菌種群差異，篩選出較適合的前處理方法，以期為建立統一標準化的發酵香腸高通量菌群分析實驗流程提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取不同發酵劑的3種薩拉米香腸樣品，分別命名為S1、S2、S3，樣品信息見表1。在保質期內對樣品進行測序分析。

表1 薩拉米香腸樣品基本信息Table 1 Information about salami samples tested in this study

QIAamp?Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒、3 mm碳化鎢研磨珠 德國QIAGEN公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS） 北京索萊寶科技有限公司；BagFilter側過濾均質袋 法國Interscience公司。

1.2 儀器與設備

BagMixer拍打式均質機 法國Interscience公司；TissueLyser II高通量組織研磨儀 德國QIAGEN公司；NanoDrop One超微量分光光度計、小型臺式離心機 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理與DNA提取

前處理方法分為3種，分別為直接提取法（M0）、拍擊均質法（M1）和振蕩珠磨法（M2），每個樣品設2個平行。按照GB/T 4789.17—2003《食品衛生微生物學檢驗 肉與肉制品檢驗》的處理方法，直接切取25 g樣品，放入滅菌研缽內用滅菌剪子切碎后，加滅菌玻璃砂研磨，攪拌混勻。M0方法，直接稱取混勻后的200 mg樣品于2 mL離心管中用于DNA提取。M1方法參考米瑞芳等[4]對酸肉中細菌群落的高通量測序分析，稱取25 g樣品，加入225 mL無菌PBS，均質機拍打2 min后，至4 ℃搖床振蕩30 min，靜置10 min后取上清液離心收集沉淀，用于DNA提取。M2方法為將樣品切碎混勻后，稱取200 mg樣品，加入1.5 mL無菌PBS和4個3 mm碳化鎢研磨珠，在高通量組織研磨儀上以30 次/s的頻率，振蕩3×1 min，每次間隔30 s以上。250×g離心5 min后取上清液，沉淀加入2 mL無菌PBS，渦旋混勻后，再次250×g離心5min后取上清液，合并上清液，15 000×g以上離心3 min收集沉淀，無菌PBS清洗3 次后，備用。

DNA提取使用QIAamp?Fast DNA Stool Mini Kit試劑盒，根據試劑盒說明書的步驟提取DNA，其中水浴溫度選擇95 ℃，使用50 μL洗脫液溶解DNA。提取的樣品DNA編號與前處理法名稱一致。DNA純度和濃度采用NanoDrop One超微量分光光度計測定。

1.3.2 細菌群落的高通量測序分析

高通量測序由北京奧維森基因科技有限公司完成。引物為343F（5′-CTCCTACGGRRSGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′）[26]，為細菌16S rDNA的V3-V4可變區，第2輪擴增引入Illumina橋式擴增引物，并利用膠回收純化擴增產物，經 Qubit 2.0精確定量后完成文庫構建，MiSeq平臺PE300測序分析。

1.4 數據處理

MiSeq測序可得到雙端序列數據，對測得的Fastq數據進行相關質控處理，最終得到優質的Fasta數據，在去除標簽和引物后，進一步去除嵌合體和短序列后得到最終序列。在97%的相似水平下，對序列使用vsearch軟件生成可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。與數據庫silva 128比對進行原核微生物的信息注釋。基于分類學信息，在各分類水平上進行群落結構的統計。利用qiime軟件進行α多樣性分析，包括物種豐富度統計（Chao1指數）、物種多樣性統計（Shannon指數、Simpson指數）。使用Venn圖軟件統計方法中共有和獨有OTU數目，分析方法間OTU數目組成相似性及重疊情況。使用SPSS 25軟件進行單因素方差分析及繪制箱形圖，其他圖在Excel中繪制完成。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果

采用上述3種前處理方法處理薩拉米香腸樣品后，M0提取的DNA平均質量濃度為（361.5±9.36）ng/μL，M1為（15.56±6.79）ng/μL，M2為（23.77±2.21）ng/μL。 3種方法得到的DNA的A260nm/A280nm比值均在1.9左右，表明純度良好。使用引物343F/806R擴增后，3種方法均可擴增出450 bp的目的條帶。雖然M1和M2的DNA質量濃度低于M0（混有樣品組織DNA），但3種方法均滿足樣品菌群結構分析的建庫需要。

2.2 OTU分布及α多樣性分析

為突出3種前處理方法間測序結果的差異性，將2個平行對照的數據合并成1個樣品數據進行分析。M0、M1和M2平均每個樣品測得原始序列為33 722、47 135、44 033 條，去除嵌合體、短序列后得到最終優質序列數目分別是29 685、42 343、39 768 條，按照97%相似性，聚類共產生417個OTU，經過抽平處理剩余405個OTU。如圖1所示，M0、M1和M2的OTU數分別為319、206和253，其中M0獨有OTU數為90個，M1獨有OTU數為33個，M2獨有OTU數為38個。方法間共有的OTU數為129個，占樣品總數的31.85%；任意兩種前處理方法共有OTU數均在140個以上，M0和M2的共有OTU數最多（200個），占樣品總數的49.38%。非共有OTU雖然數量很多，但豐度卻極低，代表并不是主要菌群。

圖1 3種前處理方法共有和獨有OTU的Venn分析Fig. 1 Venn diagram representation of shared and unique OTUs among three pretreatments

每個樣品的文庫覆蓋率均為100%，表明目前數據量的分析符合要求，已測數據可以反映薩拉米香腸樣品中絕大多數的細菌物種信息，增加測序數據已無法找到更多的OTU，詳細見表2。Chao1指數反映樣品微生物種群的豐富度，Shannon指數和Simpson指數反映樣品微生物種群的多樣性，表現微生物種群的均勻度。結果表明，M0、M1和M2的Chao1指數分別為177.93±31.02、120.76±28.60、166.96±15.63；Shannon指數分別為2.79±0.22、2.95±0.31、3.25±0.30；Simpson指數分別為0.70±0.06、0.78±0.05、0.81±0.05。Chao1指數最高的是M0，同樣品3個方法間最多相差145.98，證明M0可獲得更高的物種豐富度；種群分布最均勻、種群多樣性最高的是M2，同樣品方法間Shannon指數最多相差0.83，而Simpson指數相差最多0.15。證明不同前處理方法可對樣品的細菌種群結構產生影響。

表2 3種前處理方法的α多樣性指數Table 2 α-Diversity index of samples with three pre-treatments

2.3 細菌組成分析

在門分類水平上，3種前處理方法共有13個門（含無法鑒定），厚壁菌門和變形菌門為主要優勢細菌，此外還存在少量的放線菌門和擬桿菌門等，與國內外同類研究一致[27-29]。3種前處理方法在門水平上種群結構相似，但豐度上存在差異，其中厚壁菌門占絕對優勢，相對豐度分布為M0（85.03%）＞M2（79.21%）＞ M1（68.70%）；變形菌門的相對豐度分布分別為 M1（22.03%）＞M2（18.09%）＞M0（10.09%）；放線菌門的相對豐度分布分別為M1（8.37%）＞M0（2.83%）＞M2（1.02%）。

在科分類水平上，M0、M1和M2分別有84、74、81個科，共有科為59個，占比99.5%以上。非共有科所占比例極低，對科分類水平上種群結構影響不大，但優勢科的相對豐度存在差異（表3）。M0的優勢科細菌（相對豐度＞1%）為乳桿菌科、鏈球菌科、葡萄球菌科、明串珠菌科、腸桿菌科和短桿菌科，所占比例總和為94.19%。M1的優勢科與M0相同，但相對豐度存在差異，所占總比例為97.13%。與M0相比，M1的乳桿菌科和鏈球菌科相對豐度偏低，但腸桿菌科和短桿菌科的相對豐度顯著升高。M2的優勢科與M0和M1略有不同，黃桿菌科的相對豐度（1.32%）大于短桿菌科（0.59%），優勢菌占比94.92%。

表3 3種前處理方法提取的薩拉米香腸樣品中優勢細菌及相對豐度Table 3 Relative abundances of dominant bacteria in salami with three pretreatments

如圖2所示，在屬分類水平上，M0、M1和M2分別有112、104、115個屬，共有屬為70個，占比99%以上。M0有8個優勢菌屬，分別為乳桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌屬、葡萄球菌屬、魏斯氏菌屬、烏拉爾菌屬、檸檬酸桿菌屬和短桿菌屬，所占比例總和為90.87%。M1則有11個優勢菌屬，除上述8個菌屬外，還包括巨大球菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬，所占比例總和為93.31%。而M2有9個優勢菌屬，與M0相比，多了腸桿菌屬和克羅諾菌屬為優勢菌屬，而其短桿菌屬相對豐度小于1%，其優勢菌屬占比91.53%左右。3種前處理方法在屬水平對薩拉米香腸樣品的種群結構及相對豐度差異顯著（P＜0.05）。

圖2 3種前處理方法提取的薩拉米香腸樣品中優勢細菌及相對豐度Fig. 2 Abundances of dominant bacteria in salami with three pretreatments

3 討論與結論

高通量測序技術可對樣品中微生物進行大規模平行測序，能夠客觀反映樣品中群落構成和多樣性，已經在腸道微生物、土壤微生物、海洋微生物、食品微生物等不同類型的環境樣品中的微生態研究展開了廣泛應用，但是影響最終測序結果的因素有很多，為保證結果的可靠性以及不同研究之間結果的可比性，需要建立統一標準化的高通量菌群分析實驗流程。與糞便、土壤、海水等樣品不同，食品樣品的組成較為復雜且菌群分布并不均一，從食品樣品中提取細菌DNA時，必須對樣品進行前處理，如剪碎混勻、富集濃縮等步驟。因此，食品樣品前處理是高通量測序分析第1步。目前各項研究采取的前處理方法沒有統一的操作流程：有些研究僅將樣品切碎后，帶著食品組織直接提取DNA，有些研究則參考傳統微生物檢測的操作流程均質混勻稀釋后再進行DNA提取。不同的前處理方法是否對樣品中細菌種群結構產生影響，國內外較少報道。

本研究分析3種常用前處理方法對不同規格薩拉米香腸中細菌種群結構的影響：在DNA提取結果上，3種前處理方法采用同一個DNA提取步驟，但由于M0包含大量的樣本組織，導致M0提取的平均DNA質量濃度為（361.5±9.36）ng/μL，遠高于M1（15.56±6.79）ng/μL和M2（23.77±2.21）ng/μL，但在后續的建庫測序中，M0、M1和M2平均每個樣品得到最終優質序列數目分別為29 685、42 343、39 768 條，說明DNA的產量與測序的建庫質量沒有明顯關聯，因此僅靠DNA的產量與純度不能評價前處理方法的有效性[24,30-31]，只有盡可能獲得整個樣品中所有的微生物基因組，才能真實地反映樣品中實際的菌群結構[25]。王朝江[32]研究表明，不同的DNA提取前處理方法獲得的樣品細菌種群結構相似，但豐度上存在差異；但本研究分析的3種前處理方法，在門和科水平符合上述觀點，但在屬水平上，每種方法的優勢菌屬發生了變化，與M0相比，M1增加了巨大球菌屬、腸桿菌屬和克雷伯氏菌屬為優勢菌屬；M2則多了腸桿菌屬和克羅諾菌屬為優勢菌屬，少了短桿菌屬。這種差異取決于樣品的均一程度與前處理方法的相關特點：M0僅將樣品切碎混勻后，直接按照試劑盒的要求提取樣品DNA。由于樣品沒有經過緩沖液清洗，導致樣本中除了現存細菌之外，還含有死去細菌的游離DNA，這導致提取的DNA中，擴大了優勢菌群的比例及細菌多樣性。這種方法的優點在于操作相對簡單、快捷，且可了解樣品在發酵過程中早期存在但后期消亡的細菌；缺點是使用該方法得到的不僅有細菌DNA，還包括樣本組織DNA，從而造成線粒體和葉綠體的干擾。由于線粒體和葉綠體也含有16S rDNA，使用細菌通用引物可以將線粒體和葉綠體的序列擴增出來而被錯誤認定為變形菌門和藍 藻門[33]。此外，由于沒有經過前處理，樣本中混有大量PCR抑制因子，如多糖、多肽、鹽類、脂類及亞鐵血紅素等雜質，對DNA的純度影響很大。因此M0特別依賴后續的DNA提取方法。

M1參考傳統微生物檢測的操作流程，稱取25 g樣品后，加入225 mL無菌PBS，均質機拍打混勻靜置后，吸取上清液，離心沉淀提取DNA。這種方法的優點在于通過緩沖液洗滌及均質器的拍打，排除了優勢菌群的游離DNA及多糖、多肽、樣本組織等雜質的干擾。此外此方法由于取樣量相對較多，更有代表性，可以相對客觀地體現出樣本的菌群結構。缺點是操作相對繁瑣復雜，處理樣品的過程中容易造成污染。

M2是將樣品切碎混勻后，稱取200 mg樣品于離心管中，加入無菌PBS中，利用3 mm碳化鎢研磨珠，在高通量組織研磨儀高速振蕩撞擊。其原理是當研磨珠直徑大于1 mm時，beads-beating只能裂解動植物細胞或真菌細胞，而對細菌無影響[21]。因此選擇3 mm碳化鎢研磨珠，可通過振蕩撞擊，分散樣品組織，使細菌更好地分散在緩沖液中。再通過差速離心法除去樣本組織的干擾。其優點是操作相對簡單，且除去了優勢菌群的游離DNA及多糖、多肽、樣本組織等雜質的干擾。缺點是由于取樣量太少，不能完全的代表樣品的菌群結構。

雖然M1與M2的取樣量及后續操作差異很大，但兩種方法均去除了游離DNA，反映了樣品取樣時的實際細菌種群結構。理論上如果樣品的菌群結構完全均勻，兩種方法的分析結果應無顯著差異。但鑒于微生物的特殊性，其在食品中分布并不均勻。因此在食品微生物檢測中，制定具有代表性的采樣方案尤為重要。本研究依據GB/T 4789.17—2003中的采樣處理方法，將樣品研磨混勻后，再使用3種前方法對薩拉米香腸樣品進行多樣性分析。每種方法和每個樣品均做了平行對照。如圖2A所示，每種方法的2個平行樣本中，優勢菌群種類與豐度無顯著差異，說明方法的重復性良好，種群結構的差異源自3種前處理方法。現有的采樣方案雖然將樣品通過研磨的方式混合，但其中的細菌分布仍達不到完全均勻，取樣量依舊影響著種群結構的分析結果。當采樣方案一致時，樣品的規格越小，采取的樣品越具有代表性，其中的菌群分布相對越均勻。實驗結果表明，隨著薩拉米香腸樣品（S1、S2、S3）的規格減小時（350、100、50 g），3種方法之間的種群結構分析結果發生了變化：M1和M2的分析結果隨著樣品規格減小逐漸趨于一致。如果在后續研究中，優化采樣操作流程，使樣品在采樣時已具有一定的代表性，則 M2為更適宜的薩拉米香腸中細菌種群結構分析的前處理方法。

綜上所述，在門和科水平分析，不同前處理方法獲得的樣品細菌種群結構相似，但豐度上存在差異；但在屬水平上，不同的前處理方法可影響后續種群結構分析的結果。M0可增大優勢菌的豐度及多樣性，可應用于檢測樣品在成熟過程中存在過的細菌。而M1和M2除去了游離DNA，只留下具有完整細胞結構的細菌菌體，更能反映出樣品在取樣時的細菌種群結構。當樣品結構相對均一時，M1與M2的菌群結構和豐度趨于一致。應該盡早建立統一的高通量測序標準流程，以確保數據的可靠性以及不同研究之間結果的可比性。