NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸成熟過程中理化品質及揮發性風味物質的影響

莫 然，唐善虎,*，李思寧，李錦錦，李瓊帥，夏佳軍，蔡寅川

（1.西南民族大學食品科學與技術學院，四川 成都 610041；2.阿壩藏族羌族自治州工業經濟研究所，四川 阿壩藏族羌族自治州 624000）

肉制品是人類飲食中的重要組成部分，富含蛋白質、維生素以及礦物質[1]。牦牛肉是我國特有的肉 制品[2]，生產加工的牦牛肉制品，包括醬鹵牦牛肉、牦牛肉干、牦牛肉腸等，深受廣大消費者的喜愛。牦牛肉發酵灌腸是一種傳統的發酵肉制品，從家庭制作到作坊加工再到大型食品加工廠的批量生產，因其獨特的風味與口感，近年來備受青睞。但是，為了獲得良好的口感以及較長的保質期，通常都要求添加一定的食鹽。據研究報道，飲食中攝入過量鹽，特別是NaCl，與高血壓、心血管疾病[3]以及某些癌癥如胃癌[4]等密切相關。

在肉制品加工中，NaCl在加工技術、貯藏和感官品質3個方面都發揮著重要作用[5]。近年來，國內外有許多學者致力于香腸等高鹽含量腌制肉制品的減鹽研究。如溫榮欣等[6]報道了不同食鹽添加量對哈爾濱風干腸脂質和蛋白氧化及揮發性化合物形成的影響；Zhao Bing等[7]也探討了不同NaCl添加量對中國臘腸蛋白質氧化、脂質氧化和脂質分解的變化；Lobo等[8]開展了NaCl對發酵香腸中肉蛋白氧化還原化學機制的研究；Safa等[9]研究了直接減少NaCl含量以及減脂的互配對香腸蛋白水解、脂解、脂質和蛋白質氧化的影響。目前對香腸的減鹽研究頗多，但是主要集中在NaCl的減少引起肉制品脂質氧化以及蛋白質氧化機制方面的研究。NaCl減少除了影響蛋白質和脂肪氧化外，同樣影響肉制品其他品質特性。NaCl可以使肌原纖維蛋白溶解，提高肉的保水能力，并促進其在發酵香腸中形成凝膠，從而產生理想的質地[5]。此外，NaCl降低了水分活度，因此有助于控制微生物生長；還能調節成熟過程中的生化和酶反應，影響風味，提高咸味和肉味，改善揮發性香氣化合物從食物基質的釋放[8]，然而其效果與NaCl濃度密切相關[10]。

根據以往的工藝研究，灌腸中NaCl添加量一般在2.5%～4.0%較為常見[2-7]。本研究目的在于確定不同添加水平NaCl與牦牛肉灌腸理化特性及風味變化的關系。以不同NaCl添加量（0.0%、1.5%、3.0%、4.5%）的發酵牦牛肉灌腸為對象，通過測定4 組灌腸的pH值、保水性、色澤、質構、流變學特性、菌落總數、硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substance，TBARS）值、羰基含量、巰基含量以及揮發性風味物質的變化，探討發酵牦牛肉灌腸發酵成熟過程（0、2、4、6 d和8 d）中的理化品質變化規律，旨在為減鹽發酵牦牛肉灌腸制作和促進傳統發酵肉制品的現代化改造提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）均購于中國工業微生物菌種保藏中心。

牦牛肉購于四川省阿壩州紅原縣永源肉業，選取自然放牧狀態下3 歲齡左右健康無病公牦牛背最長肌；豬肥膘、天然豬腸衣購于成都市武侯區洗面橋橫街菜市場；食鹽、白砂糖、亞硝酸鈉、D-異抗壞血酸鈉均為食品級。

MRS肉湯、MRS培養基、平板計數瓊脂 杭州微生物試劑有限公司；2-硫代巴比妥酸、5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) 上海源葉生物科技有限公司；2,4-二硝基苯肼 成都市科隆化學品有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DHP-9052電熱恒溫培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；PHS-3C酸度計、UV1810S紫外分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；CR-400/410色差儀 日本Konica Minolta公司；TA-XT Plus質構儀 英國Stable Micro Systems公司；DISCOVERY HR-1混合流變儀 美國TA儀器公司；TRACE DSQ II型氣相色譜-質譜聯 用儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵牦牛肉灌腸的制備

參考白菊紅等[2]的方法，確定發酵牦牛肉灌腸的工藝流程如下：

原料肉預處理→切塊→拌料→腌制→絞肉→接種→灌腸→結扎、排氣→主發酵→成熟→干燥→成品

本實驗根據現有工藝，采取直接減鹽的措施共制備4 組發酵牦牛肉灌腸，其中NaCl添加量分別為0.0%、1.5%、3.0%、4.5%。將牦牛肉與豬肥膘置于4 ℃冰箱緩慢解凍，牦牛肉剔除筋膜、筋腱，豬肥膘去皮，切成2 cm×2 cm×2 cm立方體，將牦牛肉與豬肥膘按質量比8∶2混勻，加入5 g/kg白砂糖、0.5 g/kgD-異抗壞血酸鈉、0.5 g/kg亞硝酸鈉以及不同質量分數NaCl（0.0%、1.5%、3.0%、4.5%）腌制12 h。腌制后使用絞肉機（6 mm孔板）絞碎，發酵劑（V（植物乳桿菌）∶V（干酪乳桿菌）=1∶1） 以108CFU/g接種于肉餡。經充分攪拌后，灌入豬小腸中，每根灌腸長約10 cm，直徑約3 cm。洗凈腸衣表面，扎孔排氣，放入恒溫培養箱中發酵成熟。發酵香腸加工工藝參數為：發酵溫度30 ℃、發酵時間2 d，成熟溫度20 ℃、成熟時間4 d，干燥溫度45 ℃、干燥時間2 d。

1.3.2 樣品采集

在發酵牦牛肉灌腸的生產加工過程中設置5個采樣點，分別為：腌制后：原料肉腌制后絞碎接種發酵劑后的肉餡，即第0天；主發酵結束：從灌腸開始至主發酵2 d結束，即第2天；成熟中期：從主發酵結束至灌腸成熟2 d，即第4天；成熟結束：從主發酵結束至灌腸成熟4 d，即第6天；干燥結束：從成熟結束至灌腸干燥2 d，即第8天。每個采樣點各取3 份樣品用于指標測定。

1.3.3 pH值的測定

參考Vidal等[11]的方法，取5.0 g絞碎樣品與45 mL蒸餾水混合，振搖30 s后浸提30 min，取濾液用pH計測定樣品pH值并記錄。

1.3.4 保水性的測定

參照Zhao Xinxin等[12]的方法，稱取2～3 g牦牛肉灌腸，記錄樣品質量，用濾紙包裹放于10 mL帶蓋離心管內，4 ℃、10 000×g離心15 min后取出，再次稱量樣品質量，計算離心前后質量損失，得出保水性。

1.3.5 色澤的測定

灌腸去腸衣，均勻切成3 cm厚的片狀置于白色濾紙上，于C光源下利用色差儀測定產品色澤。儀器經自檢、調零以及白板校正后，將試樣平鋪樣品板底部，無隙置于載物臺上進行測量，選用L*a*b*測色系統，并記錄樣品的亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。

1.3.6 質構的測定

參考趙芩[13]的方法并作適當修改。將牦牛肉灌腸切成3 cm左右的均勻薄片，采用質構分析儀進行測定。參數設定如下：測前速率2.00 mm/s，測中速率1.00 mm/s，測后速率2.00 mm/s，模式Strain，壓縮比50%，兩次下壓間隔時間5.0 s，負載類型為Auto(Force)-5.0 g。

1.3.7 流變特性的測定

參考彭新顏等[14]的方法并稍作修改。取2～3 g肉樣，儀器經自校后，將灌腸肉糜樣品置于流變儀測試平臺上，采用夾具直徑40 mm平行板，涂布均勻，趕走氣泡并小心刮走夾具外多余樣品，兩平板邊緣用硅油涂抹，防止水分蒸發。參數設定如下：振蕩模式，頻率1 Hz，應變1%，間距1 500 μm，樣品從15 ℃線性升溫至95 ℃，升溫速率1 ℃/min，記錄肉糜儲能模量（G′）隨溫度升高的變化情況。

1.3.8 菌落總數的測定

按GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[15]中的方法測定發酵牦牛肉灌腸菌落總數。

1.3.9 TBARS值的測定

參考阮一凡等[16]的方法并作適當修改。將灌腸去腸衣絞碎稱取5.00 g，加入25 mL質量分數7.5%三氯乙酸溶液（含0.1%乙二胺四乙酸二鈉），振搖45 min，4 ℃、6 000 r/min離心5 min，取5 mL上清液，加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，在沸水浴中保溫40 min，加入5 mL氯仿混勻，靜置分層后吸取上清液，測定532 nm和600 nm波長處的吸光度A。空白組加入5 mL 7.5%三氯乙酸、5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液，其余同上。TBARS值按下式計算：

式中：V為樣品溶液體積/mL；M為丙二醛摩爾質量（72.06 g/mol）；m為稱量樣品的質量/g；l為光程/cm；ε為摩爾消光系數（152 000 L/（mol·cm））。

1.3.10 肌原纖維蛋白的提取

參考Zhao Xinxin等[12]的方法提取肌原纖維蛋白。以牛血清白蛋白為標準，采用雙縮脲法測定蛋白濃度。

1.3.11 羰基含量的測定

參考Vossen等[17]的方法。取1 mL 4 mg/mL肌原纖維蛋白溶液加入聚乙烯離心管中，然后加入1 mL 10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼溶液，室溫下避光反應40 min，每隔15 min振蕩混勻一次。此后，加入1 mL 20%三氯乙酸溶液并離心（12 000×g、5 min）除去上清液后，將沉淀用1 mL乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液洗滌3 次。加入3 mL鹽酸胍溶液（6 mol/L），37 ℃下保溫15 min溶解沉淀，離心（12 000×g、3 min）除去不溶物質，最后獲得物在370 nm波長處測吸光度。對照組開始時只加入1 mL 2 mol/L HCl溶液，其余操作相同。使用摩爾吸光系數22 000 L/（mol·cm）計算羰基含量，以每毫克蛋白含羰基量表示，單位為nmol/mg。

1.3.12 巰基含量的測定

參考扈瑩瑩等[18]的方法，并適當修改。使用5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)法對肌原纖維蛋白巰基含量進行測定。取0.5 mL配制好的蛋白溶液（4 mg/mL）與4.5 mL Tris-甘氨酸緩沖液（含0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、4 mmol/L乙二胺四乙酸、8 mol/L尿素，pH 8.0）混合，混勻后加入0.5 mL 10 mmol/L 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，空白對照為5 mL緩沖液和0.5 mL 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)混合，在40 ℃恒溫水浴鍋中反應1 h后，在412 nm波長處測定溶液吸光度。使用摩爾吸光系數13 600 L/（mol·cm）計算巰基含量，以每克蛋白含巰基量表示，單位為nmol/g。

1.3.13 揮發性風味物質的測定

參考吳倩蓉等[19]的方法并適當修改。取2.5 g絞碎樣品放入頂空瓶并壓蓋。50 ℃平衡30 min，固相微萃取針頭插入頂空瓶中萃取10 min，再插入到氣相色譜-質譜進樣器，進樣口溫度220 ℃，解吸10 min。

氣相色譜條件：色譜柱TG-WaxMS B，載氣He，色譜柱起始溫度50 ℃，保持2 min，先以15 ℃/min速率升溫至100 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min速率升溫至220 ℃，恒定流速1.0 mL/min。

質譜條件：接口溫度220 ℃，質量掃描范圍45～450 u。

定性、定量分析：所有化合物經NIST 11譜庫檢索，選擇正反向匹配值均大于800的化合物進行定性分析；根據峰面積比例對化合物相對含量（%）進行定量分析。

1.3.14 關鍵揮發性風味物質的分析

采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）[20]對發酵牦牛肉灌腸關鍵揮發性風味的貢獻進行分析。將對樣品風味貢獻程度最大的物質ROAVstan定義為100，其他物質ROAV計算公式如下：

式中：Ci為某揮發性成分相對含量/%；Ti為某揮發性成分的香氣閾值；Tstan為風味貢獻程度最大物質的香氣閾值；Cstan為風味貢獻程度最大物質的相對含量/%。

1.3.15 感官評定

邀請10 名食品專業的研究生組成評定小組，男女各半，作為感官評定員，感官評定之前明確本研究的目的、意義及感官評定的指標和需要注意的事項。將灌腸去腸衣，切成1 cm厚的片狀，隨機進行評定，每次評定由每個小組人員單獨進行，相互不接觸交流，兩組樣品評定之間提供無鹽蘇打餅干和清水漱口以清除口腔內殘留的味道。

感官評定分數采用0～20 分制，評定的指標包括色澤（0 分表示色澤蒼白或灰暗，20 分表示誘人亮紅色）、外觀（0 分表示難看、難以接受的形狀，20 分表示有非常好的灌腸形狀）、質地（0 分表示非常軟或非常硬，20 分表示軟硬適中、易于咀嚼且適口性好）、滋味（0 分表示非常咸或淡、有異味，20 分表示咸淡適中、無異味）、總體可接受性（0 分表示不能接受，20 分表示非常喜歡）5 方面。

1.4 數據處理與分析

用Excel 2016軟件做數據統計與計算；運用SPSS 25軟件中的描述統計計算平均數和標準差，采用方差分析和Duncan多重比較對數據進行差異顯著性分析 （P＜0.05，差異顯著），對揮發性風味物質進行主成分分析（principal component analysis，PCA）；利用Origin 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸pH值的影響

如圖1所示，4種灌腸在發酵成熟過程中pH值有相似的變化趨勢，這與Zhang Ying等[21]的研究結果相似。在0～2 d，pH值顯著下降（P＜0.05），這一階段是主發酵階段，原料肉中的微生物以及接種的乳酸菌（植物乳桿菌和干酪乳桿菌）利用碳水化合物形成有機酸并積累，其中主要是乳酸[22]。在2～6 d，4 組灌腸的pH值均顯著上升（P＜0.05），可能是因為灌腸中添加的乳酸菌產生脂肪酶和蛋白酶，分解脂肪和蛋白產生游離脂肪酸和氨基酸，同時伴隨著脫氨等分解反應，當產酸速率低于產氨等堿性物質生成速率，以及成熟、干燥過程中水分含量逐漸下降，共同導致pH值有所回升[23]。NaCl添加量4.5%的灌腸與其余3 組灌腸的pH值存在顯著差異 （P＜0.05），這與牛培陽等[24]的研究結果相似，可能是由于高NaCl含量對乳酸菌的產酸能力有所抑制，因而pH值相對較高。

圖1 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸成熟過程中pH值的影響Fig. 1 Effect of NaCl addition on the pH of fermented yak meat sausages during maturation

2.2 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸保水性的影響

如圖2所示，4 組灌腸保水性的變化趨勢相同，均隨著發酵時間的延長而不斷增大。NaCl添加量0.0%～3.0%，灌腸保水性隨NaCl添加量的遞增而逐漸增加，在0～8 d期間3 組間保水性均差異顯著 （P＜0.05），可以推測增加NaCl添加量對提高發酵牦牛肉灌腸保水性有一定作用。研究表明，較高的離子強度能夠提高肌肉蛋白質的溶解性，促進蛋白質三維網絡結構的形成[25]，使得灌腸中肉糜形成更好的凝膠網狀結構，水分子通過物理作用嵌入到凝膠結構中，從而提高了對水分的束縛力[26]。在4～8 d，NaCl添加量3.0%的灌腸比4.5%灌腸保水性要好，可能是因為NaCl添加量3%時鹽溶性蛋白含量最少，鹽溶性蛋白溶解形成溶膠，使得水合作用更加充分，保水性增強。

圖2 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸成熟過程中保水性的影響Fig. 2 Effect of NaCl addition on the water-holding capacity of fermented yak meat sausage during maturation

2.3 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸色澤的影響

如圖3所示，在發酵前2 d由于微生物的作用，灌腸L*有上升趨勢，隨著時間延長，L*降低。而4 組灌腸之間，在6～8 d，NaCl添加量4.5%的灌腸比其余3 組灌腸L*顯著較高（P＜0.05）。推測較高的NaCl添加量對提高肉制品L*有一定作用，而低水平的NaCl添加量對肉制品L*無顯著影響。總體來說，加工時間以及NaCl添加量對4 組灌腸a*無顯著影響（P＞0.05），這與Pietrasik等[27]對重組火腿的研究結果類似，鹽含量的減少（1.8%～1.2%）對a*沒有影響，但與De Oliveira Paula等[28]的結果相悖。隨著時間延長，4 組灌腸b*在第8天與第0天相比顯著下降（P＜0.05）。而未添加NaCl的灌腸b*顯著高于其余3 組添加NaCl的灌腸（P＜0.05）；NaCl添加量1.5%～3.0%，灌腸b*呈下降趨勢，這與O’Flynn等[29]的研究結果相似；NaCl添加量3.0%～4.5%，灌腸b*呈上升趨勢，推測可能是肉類色素的氧化產物（由于鹽含量的增加）呈現出更深的顏色[29]。

圖3 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸成熟過程中色澤的影響Fig. 3 Effect of NaCl addition on the color of fermented yak meat sausages during maturation

2.4 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸質構的影響

由表1可知，4 組灌腸的硬度、膠著性、咀嚼性的變化趨勢相似，均隨著加工時間延長顯著增大 （P＜0.05）。不同組間，隨著NaCl添加量的減少，硬度、膠著性、咀嚼性下降（P＜0.05），說明NaCl添加量對于灌腸的硬度、膠著性、咀嚼性有一定影響。這可能是由于肌原纖維蛋白在高NaCl含量的肉糜中溶解度更大，而在凝膠形成過程中這些蛋白（尤其是肌球蛋白）的可用性直接影響肉品質地[28]。添加NaCl的3 組灌腸的彈性、內聚性較未添加NaCl灌腸有顯著提升 （P＜0.05），這可能是因為NaCl能夠提高乳化穩定性，增強蛋白質與蛋白質之間的作用力，從而提高保 水性[30]。而添加NaCl的3 組灌腸之間，隨著NaCl添加量的增加，其彈性、內聚性無明顯差異，這與閆藝等[30]對馬肉肉糜的研究結果相似，這說明NaCl含量的減少對灌腸的彈性、內聚性影響不大。此外，NaCl添加量3.0%和4.5%的灌腸之間回復性無顯著差異（P＞0.05），但均較其余組顯著提高（P＜0.05）。

表1 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸成熟過程中質構的影響Table 1 Effect of NaCl addition on the texture of fermented yak meat sausages during maturation

本實驗結果表明，NaCl添加量降為0%，對灌腸的硬度、膠著性、咀嚼性、回復性影響很大，與添加NaCl的灌腸相比，彈性、內聚性也有所下降，這是由于NaCl的加入增強了肌原纖維蛋白的溶解和提取以及蛋白質基質的相互作用，因此，形成的基質會在蒸煮后形成更硬的凝膠，這種蛋白質基質中黏稠的滲出液在烹飪過程中通過膠凝化使肉糜聯結，從而改善肉品的質地[28]。隨著NaCl添加量的減少，灌腸的硬度、膠著性、咀嚼性、 回復性隨之下降。總的而言，NaCl的減少對發酵灌腸的質構特性會產生不利影響，但是NaCl添加量4.5%和3.0%灌腸的質構特性總體相差較小。

2.5 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸流變學特性的影響

彈性模量（G′）是反映溶液分子交聯程度的參數，在一定程度上反映凝膠強度[31]。在動力學加熱過程中，G′的變化可以表明蛋白質相互聚集速率的變化，反映蛋白結構解折疊和隨后的凝集變化；肉蛋白形成熱誘導凝膠的動態過程，伴隨著一系列性質的變化，包括變性、凝集和三維網絡結構的形成[31]。

圖4A反映了第0天時牦牛肉灌腸在15～90 ℃加熱過程中G′的變化，4 組灌腸G′曲線的變化趨勢基本相似。15～50 ℃，G′下降，4 組灌腸的G′均在50 ℃達到一個低熱變形峰點，可能是由于樣品受熱，大量肌原纖維蛋白發生溶解、溶脹和折疊，隨后G′又上升，在68～75 ℃時達到高熱變形峰點，隨后急劇下降。50～75 ℃這一溫度范圍內G′上升可能是由于肉糜中肌球蛋白結構開始發生變化，肌球蛋白分子間頭部與頭部發生聚集，交聯形成彈性網絡結構[32]，峰值點所對應的溫度較李德陽等[33]研究NaCl對大菱鲆肌原纖維蛋白特性影響的峰值溫度（35～40 ℃）高，這可能與肉的品種相關。與第0天時不同，第2天時未添加NaCl灌腸G′曲線的熱變形峰消失，而添加NaCl的3 組灌腸在65～70 ℃出現了較小的低熱變形峰，NaCl添加量3.5%和4.0%灌腸的低熱變形峰峰值近似相等，均低于NaCl添加量1.5%的灌腸，隨著加熱溫度繼續升高，G′曲線趨于平緩（圖4B）。第4天和第6天時，NaCl添加量0%和1.5%的灌腸的熱變形峰消失，僅NaCl添加量3.0%和4.5%的灌腸在70～75 ℃出現一個微弱的低熱變形峰，且波形明顯小于前2 d，之后隨著溫度的升高趨于平緩（圖4C、D）。第8天時，4 組灌腸的熱變形峰均全部消失，15～70 ℃范圍內G′緩慢下降，70～90 ℃以后趨于平緩，且隨著NaCl添加量的減少G′增大（圖4E）。在2～4 d，出現低熱變形峰的溫度之前，添加NaCl灌腸的G′較未添加NaCl灌腸高，說明添加NaCl灌腸彈性較好；而6～8 d，未添加NaCl灌腸的G′較高，這可能與灌腸樣品在后期硬度等質構特性較高有關。總體來說，發酵成熟過程中，NaCl添加量1.5%和3.0%灌腸的G′較好。

圖4 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸G′的影響Fig. 4 Effect of NaCl addition on the storage modulus of fermented yak meat sausages

2.6 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸菌落總數的影響

如圖5所示，在整個發酵成熟期間，4 組灌腸的菌落總數均呈先增加后降低的趨勢（P＜0.05）。這是由于0～2 d牦牛肉發酵灌腸處于主發酵階段，在適宜的溫度及濕度下，乳酸菌作為發酵優勢菌快速增長；之后4～6 d處于低溫成熟階段，溫度下降，微生物活性受到抑制，后期營養物質減少、微生物可利用水分減少也抑制了灌腸中微生物的生長，此外，乳酸菌發酵產酸，低pH值在一定程度上可能會抑制某些微生物的生長，例如大腸桿菌[34]；而至8 d，由于高溫干燥，灌腸中的微生物急劇下降。總體來說，NaCl添加量0.0%與1.5%、3.0%與4.5%的灌腸之間菌落總數差異較小，但低NaCl添加量（0.0%和1.5%）與高NaCl添加量（3.0%和4.5%）之間差異顯著（P＜0.05）。這說明，NaCl添加量大幅度下降會促進微生物的生長，降低灌腸的貯藏品質；而適當降低NaCl添加量，對微生物的影響不大。這與Charmpi等[35]報道的添加4.0%鹽肉糜中腐敗微生物數量較添加0%～3%鹽的肉糜要低的結果一致。

圖5 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸成熟過程中菌落總數的影響Fig. 5 Effect of NaCl addition on the total bacterial count of fermented yak meat sausage during maturation

2.7 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸TBARS值的影響

肉制品中脂質氧化對產品特性有很大影響，會產生令人不愉快的氣味和質地，以及導致部分必需脂肪酸的損失[36]。如圖6所示，隨著時間的延長，灌腸的TBARS值顯著增加（P＜0.05）。在0～2 d，NaCl添加量對灌腸的TBARS值影響較小；在4～8 d，隨著發酵、成熟、干燥的進行，4 組灌腸之間TBARS值差異顯著 （P＜0.05），且隨著NaCl添加量減少，TBARS值顯著增加（P＜0.05）。另一方面，未添加NaCl灌腸較NaCl添加量1.5%和3.0%灌腸TBARS值低（P＜0.05），而較NaCl添加量4.5%灌腸的TBARS值高（P＜0.05）。在一定鹽度范圍內，鹽作為一種促氧化劑[37]，隨著NaCl添加量的增加，脂質氧化程度增加，因此NaCl添加量1.5%和3.0%的灌腸較未添加NaCl灌腸的TBARS值高。目前NaCl引發或催化脂質氧化的機理尚未完全闡明，其機制可能歸因于NaCl破壞細胞膜完整性，促進氧化劑進入脂質基質，從含鐵分子中釋放鐵離子，如血紅素蛋白；或抑制抗氧化酶如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性[38]。在本研究中，隨著NaCl添加量從4.5%降低到1.5%，TBARS值升高，可能是由于鹽促脂質氧化作用受離子濃度的影響，高濃度的離子環境反而會抑制脂質氧化的進行[39]，這與柴子惠等[40]的研究結果相似，高鹽（6%）較低鹽（4%）臘肉的TBARS值低，說明鹽濃度對灌腸脂質氧化有一定影響。

圖6 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸成熟過程中TBARS值的影響Fig. 6 Effect of NaCl addition on the TBARS value of fermented yak meat sausages during maturation

2.8 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸羰基、巰基含量的影響

蛋白質羰基的形成主要通過金屬催化氧化、非酶糖化和其他物質與蛋白質絡合3種途徑[41]。肉中天然存在的金屬離子，如Fe2+，可以刺激O2和H2O2產生氧自由基，是一種自由基鏈式反應。反應開始較慢，因為起始鏈反應的活化能較高，然后蛋白質氧化反應迅速，精氨酸、賴氨酸、脯氨酸和蘇氨酸的側鏈上產生羰基[7]。 因此羰基含量常被用來反映蛋白質的氧化程度。如 圖7A所示，4 組灌腸的羰基含量均隨著時間的延長而增加（P＜0.05）。隨著NaCl添加量減少至1.5%，羰基含量呈遞減趨勢（P＜0.05），這與Zhao Bing等[7]的研究結果相似。這是由于肉制品中的NaCl能通過Fenton反應，將氧肟蛋白中的二價鐵（Fe2+）改變為高鐵肌紅蛋白的三價鐵（Fe3+），從而增加其親氧化電位，隨后形成活性氧，促進蛋白質的氧化[42]；另一方面，也可能是蛋白質的氧化還原狀態受到離子驅動效應的影響[8]。而除0 d外，未添加NaCl與NaCl添加量4.5%灌腸的羰基含量無顯著差異（P＞0.05），可能是由于鹽含量較少，微生物數量增加，產生的外源蛋白酶作用于肌肉蛋白使其發生不同程度水解、氧化[43]。此外，脂質氧化產生自由基也會驅動蛋白質氧化[7]，而上述提到NaCl添加量超過一定范圍會抑制脂質氧化的作用，因此兩種作用綜合導致NaCl添加量1.5%和3.0%灌腸中的羰基含量低于未添加NaCl灌腸。巰基含量是衡量蛋白質氧化的另一個常用指標，半胱氨酸的巰基對氧化過程非常敏感，它們的氧化導致二硫鍵形成；巰基含量越低，蛋白質的氧化程度越大[9]。如圖7B所示，4 組灌腸的巰基含量均隨著加工時間的延長而下降（P＜0.05）。隨著NaCl添加量由4.5%減少至1.5%，巰基含量呈遞增趨勢（P＜0.05）；此外，未添加NaCl的灌腸與NaCl添加量4.5%的灌腸的巰基含量無顯著差異（P＞0.05）。巰基含量的總體變化與羰基含量結果相同，隨著NaCl添加量的減少，樣品蛋白質氧化作用降低，這進一步說明NaCl對于肉制品蛋白質氧化有誘導作用，適量降低NaCl添加量有助于控制蛋白質的氧化，這與溫榮欣等[6]的研究結果一致。

圖7 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸成熟過程中羰基含量（A）和 巰基含量（B）的影響Fig. 7 Effect of NaCl addition on the protein carbonyl (A) and sulfhydryl (B) contents of fermented yak meat sausages during maturation

2.9 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸揮發性風味物質的影響

由表2可知，4 組灌腸在發酵成熟過程中共鑒定出131種揮發性風味物質。一般而言，發酵灌腸的風味受原料、發酵劑、加工方式等多種因素的影響[44]。而發酵牦牛肉灌腸的揮發性風味物質的產生途徑主要有碳水化合物代謝、脂質氧化、氨基酸分解代謝、酯化等[45]。

表2 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸成熟過程中揮發性風味物質的影響Table 2 Effect of NaCl addition on volatile flavor compounds in fermented yak sausages during maturation

由于檢測出的揮發性風味物質變量較多，對其難以進行系統分析，且發酵牦牛肉灌腸的總體風味貢獻程度主要由感覺閾值和含量共同決定，因此采用PCA法簡化數據，以得到不同變量之間的關系[46]，并通過ROAV法來確定所分析樣品的關鍵風味化合物[20]。

由圖8可知，構成發酵牦牛肉灌腸的揮發性風味物質有3個PC，其貢獻率分別是31.360%、21.387%、17.891%，累計貢獻率達70.638%，各PC的特征根均大于1，因此這3個PC能夠較好地反映發酵牦牛肉灌腸在成熟過程中揮發性風味物質相對含量的變化。其中構成PC1主要為酸類、醇類、醛類、酯類；PC2主要為烯類、其他化合物；PC3為酮類物質。由得分散點圖（圖9）可以看出，不同發酵時間、不同組別的樣品在PC上的得分具有差異，在發酵初期各組樣品較為分散，添加了NaCl的灌腸在PC1上的得分最高，未添加NaCl的灌腸在PC2上的得分最高；而在成熟干燥后，4 組樣品分布集中。

圖8 揮發性風味物質的因子載荷分析圖Fig. 8 PCA factor loading plot of volatile flavor substances

圖9 樣品在不同PC上的得分散點圖Fig. 9 PCA score scatter plot of samples

不同發酵時間各樣品關鍵風味貢獻結果如圖10所示。共確定12種關鍵風味物質（ROAV≥1），隨著時間的延長，各加工階段關鍵風味物質的種類呈遞增趨勢，這可能是由于初期微生物的代謝分解作用，產生醇類物質，而醇類物質不斷生成醛類物質以及酸類物質，隨著加工的進行以及溫度的變化，脂質氧化、美拉德反應等加劇，使得風味物質含量增加[6]。

圖10 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸成熟過程中ROAV的影響Fig. 10 Effect of NaCl addition on ROAV of fermented yak sausages during maturation

第0天腌制結束時，樣品在PC2上的得分最高，主要由烯類和其他物質（包括苯類和含氮類化合物）構成。但是由于這兩類物質感知閾值偏高，ROAV＜0.1，不被認為是關鍵風味物質。

第2～6天發酵、成熟期間，樣品在PC1上的得分最高，主要由酸類、醇類、醛類、酯類構成。脂質氧化是發酵灌腸特有氣味和風味形成的關鍵因素，負責形成脂肪族醛、酮、烷烴及其相應的酸、酯和醇等重要揮發性物質[47]。隨著加工的進行，醛類物質的相對含量呈遞增趨勢，NaCl添加量1.5%和3.0%灌腸的醛類物質相對含量最高，其次是未添加NaCl的灌腸，而NaCl添加量4.5%的灌腸最低。在發酵牦牛肉灌腸中主要檢出己醛、壬醛、異戊醛、庚醛等，這些物質主要源于脂質氧化[47]。這說明低NaCl添加量對脂質氧化有促進作用，而相對較高的NaCl添加量對脂質氧化有一定的抑制作用，與TBARS值結果一致。由于醛類物質如己醛、壬醛、異戊醛等感知閾值較低[48]，且相對含量較高，因此成為發酵牦牛肉灌腸的關鍵風味物質。醇類、酸類、酯類物質主要是由發酵成熟過程中微生物的代謝作用產生[47]。醇類和酯類物質種類較多，發酵初期相對含量較大，不同NaCl添加量的灌腸間變化趨勢不明顯。而在檢出的醇類物質中，僅有1-辛烯-3-醇為關鍵風味物質（ROAV≥1），1-辛烯-3-醇具有蘑菇香、花香，是香腸風味中最具代表性的不飽和醇[49]，其合成的代謝途徑包括甲基酮還原、氨基酸代謝和脂質氧化[50]。

第8天干燥結束時，樣品在PC3上的得分較高，由酮類物質構成。在被檢測出的酮類物質中只有3-羥基-2-丁酮作為關鍵風味物質，且僅在3個樣品中檢測到。NaCl添加量4.5%的灌腸酮類物質相對含量在加工后期遠高于其他組，一般而言酮類物質的產生是由于脂肪酸的β-氧化產生[50]，由此可以推測第8天，NaCl添加量4.5%的灌腸β-氧化作用較強。

2.10 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸感官品質的影響

不同NaCl添加量的發酵牦牛肉灌腸（8 d）感官評分如表3所示。隨NaCl添加量的減少，發酵牦牛肉灌腸的外觀、質地、滋味、總體可接受性的感官評分均呈下降趨勢（P＜0.05），但NaCl添加量3.0%和4.5%的灌腸之間差異不顯著（P＞0.05）。這說明NaCl添加量影響灌腸的感官品質，這與Fellendorf等[51]研究的鈉鹽含量對白布丁香腸的感官分析結果相似。而色澤評分，除NaCl添加量4.5%的灌腸較其他灌腸高（P＜0.05），其余組間均無顯著差異（P＞0.05）。綜上，直接降低鹽含量會影響牦牛肉發酵灌腸的感官評分，而適量的減少其總體可接受性無顯著變化。

表3 NaCl添加量對發酵牦牛肉灌腸感官評分的影響Table 3 Effect of NaCl addition on sensory evaluation of fermented yak meat sausages

3 結 論

本研究中4 組灌腸在發酵成熟過程中理化性質、菌落總數以及揮發性風味物質的變化趨勢大致一致。NaCl添加量為4.5%的灌腸的pH值和L*最高，而NaCl添加量3.0%的灌腸保水性最好且b*最低；隨著NaCl添加量的減少，硬度、膠著性、咀嚼性呈下降趨勢，而G′、菌落總數呈上升趨勢。此外，NaCl添加量對灌腸的脂質、蛋白質氧化有一定影響，隨著NaCl添加量從4.5%減少到1.5%，脂質氧化程度增加，而蛋白質氧化程度降低。發酵牦牛肉灌腸中共檢出7 大類揮發性風味物質，通過PCA得到3個PC，累計貢獻率達70.638%，ROAV法分析得到12種關鍵揮發性風味物質（ROAV≥1），不同加工時間各樣品的得分情況不同，且隨著NaCl添加量從4.5%減少到1.5%，其脂質氧化產物醛類的相對含量增大。另外，發酵牦牛肉灌腸的外觀、質地、滋味、總體可接受性的感官評分隨NaCl添加量從3.0%到0.0%的減少呈下降趨勢（P＜0.05），而NaCl添加量為3.0%和4.5%的灌腸之間差異不顯著（P＞0.05）。綜合分析，直接減少NaCl添加量對產品的品質有一定的影響，但減少至3.0%產品在可接受范圍內，且脂質氧化、蛋白質氧化情況適中。