氨基酸對丙酮醛和甲醛的消除效果及其機理分析

胡嘉漫，黃才歡,2，鄭 潔,2，歐仕益,2，李瑞陽，歐雋瀅

（1.暨南大學理工學院，廣東 廣州 510632；2.焙烤食品安全粵港聯合創新平臺，廣東 廣州 510632；3.暨南大學食品安全與營養研究院，廣東 廣州 510632）

丙酮醛（methylglyoxal，MGO）又名甲基乙二醛，是具有高反應活性的α-二羰基化合物[1]。在食品加工過程中，MGO主要源于美拉德反應中的Schiff堿和Amadori化合物[2]。MGO廣泛存在于面包、餅干、咖啡、奶酪、蜂蜜[3-4]和飲料（碳酸軟飲料）[5]以及香煙煙霧[6]中，食品在熱加工過程（油炸、焙烤）[7-9]甚至貯藏過程中[10]均會產生MGO。在生物體內（包括人體中），MGO主要由糖酵解途徑產生，可通過3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮自發形成，在白醋、酒等發酵食品中也含有MGO[2,11]。MGO的口服半致死劑量為1 165 mg/kg，具有細胞毒性[12]。 其化學性質非常活潑，可與食品組分形成有害衍生物，包括晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）、丙烯酰胺和4(5)-甲基咪唑[13]。MGO被人體攝入后，不僅會誘發體內活性氧產生，而且容易通過血液循環運輸到全身組織，損傷生物大分子，如蛋白質、DNA、RNA、膜脂（含氨基的磷脂）等[14]。研究表明，MGO是高血糖和糖尿病并發癥的主要致病因素之一[15]，而且MGO、AGEs的形成和積累與衰老相關疾病密切相關，包括癌癥、神經退行性疾病、糖尿病和動脈粥樣硬化[16]。由此可見，降低MGO水平可能是抑制AGEs形成、預防和治療相關疾病的有效方法。

甲醛是最活潑的脂肪醛[17]，它既可以由食品內源性產生，也可通過外源添加或環境污染存在于食品中[18]。甲醛是細胞的代謝產物，廣泛存在于人體內和各種動植物組織中。食品在加工或貯存過程中會通過美拉德反應和熱降解反應生成甲醛，尤其是酒、面包等發酵性食品[19]。 甲醛已被國際癌癥研究機構列為第一類致癌物，是影響人類健康最危險的化學物質之一[20]。甲醛不僅可與視紫紅質蛋白質中賴氨酸的胺官能團發生反應，而且還會與其他蛋白質（包括許多酶）中的氨基發生反應，這些生物催化劑功能的喪失會導致死亡[18]。

科學家們一直致力于研究降低或清除食品中MGO的方法。目前研究最多的MGO清除劑主要為多酚，包括茶多酚、槲皮素、白藜蘆醇和姜黃素等[21]。槲皮素可以在生理條件下[22]和小鼠體內[23]通過捕獲MGO形成單或雙MGO-槲皮素加合物而清除MGO。盧永翎等[24]證明，槲皮素和MGO形成單和雙MGO-槲皮素加合物后仍對MGO具有清除作用。當槲皮素的A環位置被MGO占據時，槲皮素的B環可再捕獲1個MGO形成三MGO-槲皮素加合物。但在有些模擬體系中，多酚會促進其他有害物質，如1-/3-脫氧奧蘇糖、HMF的形成，從而產生二次毒害[25-26]。 Jiang Kaiyu等[27]通過模擬唾液、胃液和腸液等消化體系，對豬肉、雞肉、奶粉和大豆分離蛋白進行體外模擬胃腸消化實驗，發現蛋白質水解產物對MGO具有清除作用，從而減輕了MGO對結腸癌Caco-2細胞的毒性。并在后續實驗中構建了模擬生理反應體系[27]以及熱加工模擬體系[28]，兩種體系中MGO和氨基酸的濃度比為1∶10，模擬生理反應體系的pH值為2.0或7.0、反應溫度為37 ℃，模擬熱加工反應體系的pH值為7.0、反應溫度為160 ℃，實驗結果證明對MGO具有消除作用的成分是蛋白質的水解產物氨基酸，但氨基酸對MGO的清除機理尚待研究。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白質氨基酸，屬于新資源食品。它廣泛存在于哺乳動物、植物和微生物中，尤其在谷物、茶葉、蔬菜等食品中含量較高。例如，在馬鈴薯中含量高達660 mg/kg[29]，僅次于天冬酰胺；在糙米中含量為236.6 mg/kg[30]。GABA參與多種代謝活動，具有很高的生理活性。在神經系統調節方面也具有重要作用，如可以促進神經元生長，以及預防失眠、焦慮和抑郁等[31]。另外，GABA對高胰島素血癥還可能具有緩解作用[32]。

本實驗采用模擬體系，研究14種氨基酸對MGO的消除效果，以對MGO消除效果好、食品中含量較高的GABA為對象研究其消除機理，并在此基礎上，表征產物結構，研究可能的反應機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MGO（質量分數40%） 上海麥克林生化科技有限公司；甲醛（質量分數40%）、氫氧化鈉、鹽酸 天津大茂化學試劑廠；L-甘氨酸（Gly，99%）、GABA（99%）、L-絲氨酸（Ser，99%）、L-脯氨酸（Pro，99%）、L-丙氨酸（Ala，99%）、L-組氨酸（His，99%）、L-賴氨酸（Lys，98%）、L-甲硫氨酸（Met，99%）、L-纈氨酸（Val，99%）、L-異亮氨酸（Ile，99%）、L-精氨酸（Arg，99%）、L-天冬酰胺（Asn，99%）、L-半胱氨酸（Cys，99%）、L-色氨酸（Trp，99%）、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH） 北京百靈威科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）、鄰苯二胺 德國默克試劑有限公司；氘代甲醇 美國Cambridge Isotope Laboratories公司；A-HG型十八烷基硅烷（octadecylsilane，ODS）鍵合相吸附劑 日本東京YMC公司；分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、8045三重四極桿液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）儀（配有電噴霧離子源） 日本島津儀器公司；N-1300型旋轉蒸發儀 東京理化器械株式會社；SHA-BA恒溫振蕩器 江蘇金壇醫療儀器廠；X500R QTOF型高分辨質譜儀 美國SCIEX公司；HR-200分析天平 日本A&D公司； 600 MHz Avance III型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 瑞士布魯克公司；Scientz-10N型真空冷凍干燥機 寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氨基酸對MGO的清除作用

用蒸餾水配制氨基酸（Pro、Ala、His、Lys、Met、Val、Ile、Ser、Arg、Gly、GABA、Asn、Cys、Trp）和MGO溶液，濃度均為50 mmol/L，將每種氨基酸溶液分別與MGO溶液按體積比1∶1混合，取4 mL混合溶液置于10 mL具塞比色皿中，于80 ℃水浴反應4 h后，冷卻。參考吳泰鋼等[33]報道的檢測方法，利用鄰苯二胺對MGO進行衍生反應后，過0.22 μm有機微孔濾膜，采用HPLC儀檢測未被消除的MGO。檢測條件：ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為體積分數0.1%乙酸溶液和甲醇（30∶70，V/V），進樣體積10 μL，流速1 mL/min，柱溫40 ℃；檢測波長314 nm。

1.3.2 GABA對MGO和甲醛的同時消除作用

向10 mL鋼管中分別加入一定體積的GABA、MGO溶液和甲醛，使其終濃度分別為40、4 mmol/L和4 mmol/L， 用0.1 mol/L的NaOH溶液或鹽酸將體系pH值調為7.0，反應液（總體積6 mL）充分混勻后于160 ℃下分別反應5、15、30、45、60 min。采用同樣的反應體系，于10 mL具塞比色管中加入GABA、MGO溶液和甲醛各2 mL，其終濃度分別為40、4 mmol/L和4 mmol/L，用0.1 mol/L的NaOH溶液或鹽酸調節體系pH值為2.0或7.0，溶液混勻后在37 ℃下水浴反應2 h。

反應結束后，參考Jiang Kaiyu等[27]的檢測方法，以DNPH衍生法測定體系中MGO和甲醛的剩余量。具體方法如下：蒸餾水調節至相應pH值，用其將待測溶液稀釋10 倍后取200 μL于5 mL試管中，再加入1.8 mL乙腈和1 mL 12.5 mmol/L DNPH溶液（以體積比9∶1的乙腈-濃鹽酸為溶劑配制），混勻后于60 ℃水浴衍生2 h。衍生反應后樣品過0.22 μm有機微孔濾膜待HPLC儀（配有SPD-M20A光電二極管陣列檢測器）檢測。檢測條件：ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為超純水-乙腈（30∶70，V/V），進樣體積10 μL，流速1.2 mL/min，柱溫40 ℃；檢測波長352 nm（甲醛衍生物）和425 nm（MGO衍生物）。甲醛和MGO均以標準物質衍生后進樣，每個標準樣品進行3 次平行實驗后，繪制標準曲線，以標準曲線計算得出樣品中甲醛和MGO的剩余量。

1.3.3 反應產物的初步鑒定

利用HPLC儀以及HPLC-MS/MS儀對反應產物進行檢測。選擇ZORBAX SB-Aq色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。HPLC分析程序設置如下：流動相為體積分數0.1%乙酸溶液和甲醇（95∶5，V/V），進樣體積1 μL，流速0.6 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長220 nm。HPLC-MS/MS 分析程序設置如下：流動相為體積分數0.1%乙酸溶液和甲醇（95∶5，V/V），進樣體積0.1 μL，流速 0.4 mL/min，柱溫40 ℃；離子源為電噴霧離子源，掃描范圍m/z50～800，離子源溫度300 ℃，去溶劑化溫度250 ℃，毛細管電壓4 000 V，掃描速率1 000 Da/s，碰撞能量30 eV。

1.3.4 加合物的制備及分離純化

分別取GABA、MGO溶液和甲醛于裝有30 mL去離子水的100 mL三角瓶中，終濃度分別為0.2、0.1 mol/L和0.1 mol/L，于37 ℃水浴反應12 h。反應后通過旋轉蒸發儀將反應液濃縮得到1 mL樣品，樣品經0.22 μm有機微孔濾膜過濾后用膠頭滴管滴加到反相硅膠層析柱（ODS填料）上端，通過柱層析法分離純化反應產物。參照鄒照佳等[34]的方法裝柱和平衡層析柱。玻璃層析柱規格為30 mm×600 mm，反相硅膠填料體積350 mL，體積分數5%甲醇溶液作為洗脫液，等度洗脫，流速3 s/滴，各餾分體積為5 mL。采用碘熏法監測餾分的成分，具體操作如下：利用毛細管吸取少量餾分點于定性濾紙上，將定性濾紙置于裝有硅膠和少量單質碘的磨口廣口瓶中進行顯色反應。取顯深棕色的餾分過0.45 μm微孔濾膜后于HPLC和HPLC-MS/MS測定加合物的純度，最后合并高純度的餾分，通過旋轉蒸發去除溶劑，用去離子水復溶后進行冷凍干燥收集固體樣品。

1.3.5 加合物的結構鑒定

將純度大于95%的餾分，采用HPLC-MS/MS對加合物進行初步鑒定，獲得一級、二級質譜，分析條件同1.3.3節。另外，采用高分辨質譜儀（離子源為電噴霧離子源，掃描范圍m/z50～1 500）分析目標加合物樣品，獲得精確相對分子質量。取25 mg固體樣品溶于600 μL氘代甲醇中，采用NMR儀（600 MHz）獲得目標加合物的1H NMR、13C NMR和Dept-135譜圖。

1.4 數據處理與分析

實驗數據采用Microsoft Excel軟件處理，以±s表示。應用SPSS 25.0軟件對實驗數據進行差異顯著性分析（P＜0.05，差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 氨基酸對MGO的清除作用

如圖1所示，所有氨基酸對MGO均具有一定消除能力，半胱氨酸對MGO的消除率最高（90%）；其次為賴氨酸、GABA和甘氨酸，消除率分別為78%、77%和70%。消除率超過50%的氨基酸還有絲氨酸（59%）、丙氨酸（51%）、甲硫氨酸（54%）、色氨酸（63%）、精氨酸（61%）和組氨酸（62%）。半胱氨酸消除效果最好的可能原因是其不僅含有氨基，可以與MGO的醛基反應形成Schiff堿，而且還含有更加活潑的巰基，能與MGO反應生成半縮硫醛或縮硫醛。

圖1 氨基酸對MGO的清除作用Fig. 1 Elimination capacity of methylglyoxal by amino acids

2.2 GABA同時消除MGO和甲醛的能力

利用鄰苯二胺作為衍生劑檢測MGO的剩余量，評價在甲醛存在下GABA對MGO的消除作用。在37 ℃、pH 2.0或7.0條件下，GABA對MGO的消除能力如表1所示。結果表明，GABA在pH 7.0的中性反應體系中對MGO的清除能力比在pH 2.0的酸性體系中強；在含甲醛的反應體系中，GABA對MGO的清除效果較不含甲醛的反應體系更好。在pH 7.0、不加甲醛時，GABA對MGO的消除率只有59.6%，加入甲醛后，GABA對MGO的消除率增至81.2%。這說明甲醛的存在可以促進GABA對MGO的消減。

表1 37 ℃下GABA對MGO的消除率Table 1 Elimination rate of methylglyoxal by GABA at 37 ℃

利用DNPH同時對甲醛和MGO進行衍生，測定160 ℃反應體系中甲醛和MGO的剩余量，以此評價熱加工模擬體系中GABA對甲醛和MGO的同時消除效果。如表2所示，隨著加熱時間的延長，甲醛和MGO持續減少，直到30 min后，兩種羰基化合物剩余量基本穩定。模擬體系加熱5～15 min，GABA對甲醛的消除率不到40%，對MGO的消除率只有45%左右，而加熱30 min，GABA對甲醛和MGO的消除率分別達到了91.3%和78.8%。在高溫加熱模擬體系中，GABA對MGO和甲醛均具有良好的消減效果。這一發現說明，當食品體系中MGO和甲醛同時存在時，GABA不僅可以更好地消除MGO，而且還可能顯著降低甲醛含量。

表2 160 ℃下GABA對MGO和甲醛的消除率Table 2 Elimination rates of methylglyoxal and formaldehyde by GABA at 160 ℃

2.3 反應產物的分離純化

37 ℃水浴2 h，GABA-甲醛-MGO反應產物的HPLC圖如圖2A所示。除GABA（4.020 min）外，產物中還有一個較高的峰（10.157 min，目標產物），經紫外全波長掃描，得知產物的最大吸收波長為220 nm（圖2B）。

圖2 GABA與甲醛和MGO共同反應后產物的HPLC圖譜（A）及 目標產物的紫外全波長掃描圖（B）Fig. 2 HPLC chromatogram (A) and ultraviolet spectrum (B) of the reaction products of GABA, formaldehyde and methylglyoxal

GABA和產物的保留時間明顯不同，說明兩者的極性相差較大，因此，本研究采用反相硅膠層析柱（ODS填料）分離純化目標產物。如圖3所示，采用反相硅膠純化后，只有一個單一峰，說明純化效果良好。DNPH被用作醛類和酮類的顯色劑，而純化后的目標產物不能使DNPH顯色，說明產物中沒有醛基或酮基。碘熏法是一種利用有機物遇碘蒸氣能顯黃色或黃棕色的顯色方法。利用碘熏法監測餾分，餾分中含有純化產物時，碘蒸氣吸附于產物上而顯棕色。含有氮原子和不飽和鍵，尤其是含有環內雙鍵的化合物會使碘顯色更明顯。可以看出，濾紙上的產物為深棕色，說明目標產物保留了GABA的氮原子，且可能含有碳碳雙鍵或環。

圖3 純化后目標產物的HPLC圖以及碘熏法顯色情況Fig. 3 HPLC chromatogram of purified product and color development using iodine fuming

2.4 加合物的結構鑒定

純化產物的HPLC-MS/MS一級、二級質譜和高分辨質譜圖分別如圖4A～C所示。一級質譜圖中的2個峰分別為[M+H]+m/z255和[M+Na]+m/z277，可以確定目標產物的相對分子質量為254。由高分辨質譜儀分析得到加合物的準確相對分子質量為254.133 9，分子式為C12H18N2O4。不飽和度（缺氫指數）常用來衡量有機化合物的不飽和程度，泛指結構中不飽和鍵（如雙鍵）和環數的總和[35]。高分辨質譜結果顯示，該產物的不飽和度為5，推測其可能結合了兩分子GABA，除了2個羧基以外，還有可能是MGO和甲醛的醛基分別和兩分子GABA的氨基形成兩分子Schiff堿（含有2個雙鍵），此外，還有可能含有一個不飽和度為1的環狀化合物。由二級質譜圖可知，目標產物脫去2個羧基和1個亞甲基得到m/z151的碎片峰，再分別脫去2個亞甲基和3個亞甲基得到m/z123和m/z109的碎片峰，綜上所述，可以由目標產物得到的最小碎片峰以及醛基和氨基的反應機理推斷，可能形成了1個咪唑環。

圖4 純化產物的MS1（A）、MS2（B）和高分辨質譜圖（C）Fig. 4 MS1 (A), MS2 (B) and high resolution mass spectrum (C) of the purified product

經純化后的目標產物的13C、1H NMR譜和Dept-135譜圖如圖5所示。由Dept-135譜圖可知目標加合物含有6個亞甲基，與加合物結合的兩分子GABA上的亞甲基數目對應。13C NMR譜中共包含12個碳信號，其歸屬如下：δ176.51（—COOH）、31.64（—CH2COOH）、25.27（—CH2CH2COOH）、46.16（—CH2CH2CH2COOH）、176.44（—COO-）、31.71（—CH2COO-）、25.74（—CH2CH2COO-）、48.81（—CH2CH2CH2COO-）、135.56（環內—NCH＝N+）、119.38（環內—NCH＝C）、131.86（環內—CH＝C—N+）、7.59（—CH3）。由1H NMR譜可知加合物包含9種氫類型，分別為：δ2.36（—CH3，3H）、2.29（—CH2COOH，2H）、2.11 （—CH2CH2COOH，2H）、4.19（—CH2CH2CH2COOH，2H）、2.34（—CH2COO-，2H）、2.13 （—CH2CH2COO-，2H）、4.20（—CH2CH2CH2COO-，2H）、7.38（環內—NCH＝C，1H）、8.92（環內 —NCH＝N+，1H）、3.31（CH3OD）、4.89（D2O）。氫譜中化學位移為δ7.38和δ8.92的兩組峰分別與咪唑環上的兩種氫原子對應。NMR結果表明該化合物為3-(3-羧丙基)-1-(3-羧丙基)-4-甲基-1H-咪唑。

圖5 目標加合物的1H NMR譜（A）、Dept-135譜（B）、13C NMR譜（C）Fig. 5 1H NMR spectrum (A), Dept-135 spectrum (B) and 13C NMR spectrum (C) of the adduct

結合HPLC-MS/MS的圖譜數據，碎片離子m/z169表示[—CH2CH2COO-]和[—CH]的損失，而m/z109是帶有1個甲基的咪唑環。因此，推測其反應機理為：兩分子GABA捕獲一分子MGO和一分子甲醛，GABA的氨基與甲醛反應生成中間產物Mannich堿，該反應在常溫下就可發生。由于N原子的吸電子效應，導致α-C上正電荷堆積，另一分子GABA與之發生親核加成反應形成另一個含2個亞氨基的中間產物；2個亞氨基同時進攻MGO的2個羰基碳，形成一個五元環化合物，然后分子內脫去兩分子H2O，形成咪唑鹽（圖6）。由于活潑中間產物Mannich堿的形成、以及加成和脫水反應都在分子內發生，使得反應非常容易進行，因此，MGO的消除效率大大提高。GABA在馬鈴薯中的含量很高，僅次于天冬酰胺，在噴霧干燥的馬鈴薯片中含量為660 mg/kg[29]。因此，GABA可能與油炸或烘焙等熱加工過程中產生的MGO和甲醛形成該產物。

圖6 GABA與MGO和甲醛同時反應的可能機制Fig. 6 Possible mechanism for the simultaneous reaction of GABA with methylglyoxal and formaldehyde

3 結 論

在37（生理條件）、80 ℃和160 ℃下，GABA均能有效消減MGO（消除率在77%以上），甲醛的加入促進了 GABA對MGO的消減。經產物分離純化和結構表征，GABA同時與MGO和甲醛反應，產生一個相對分子質量為254（最大吸收波長220 nm）的含氮五元環化合物，其形成機理是：2 分子GABA與1 分子甲醛和1 分子MGO通過親核加成反應脫去3 分子水后形成咪唑鹽。本研究結果表明，在消化和熱加工過程中，補充GABA能有效清除MGO和甲醛，避免其危害人體健康；但產物（咪唑鹽）的安全性還有待進一步研究。