基于智能感官和氣相色譜-質譜聯用技術研究食鹽添加量對風干腸風味特征的影響

李永杰，唐 月，李慧瑤，孔保華，王見釗，任 靜，陳 倩

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

食鹽是傳統肉制品加工中必不可少的成分，其既能增加肌原纖維蛋白的溶解性，改善肉制品的保水性和加工特性，又可降低水分活度（aw），抑制腐敗微生物生長代謝，提高產品的安全特性[1-2]；另外，NaCl對傳統肉制品的風味形成也有著重要作用，一方面具有咸味和增鮮作用，另一方面還可影響蛋白質和脂質等營養物質的水解和氧化，進而影響相應風味物質的產生[3-5]。但長期過量食用高鈉鹽食品會增加患高血壓、心血管疾病、骨質疏松、中風、慢性腎臟疾病、胃癌和肥胖等諸多疾病的風險[6-8]。為此，世界衛生組織和《中國居民膳食指南》分別于2012年和2016年提出成人每日NaCl攝入量應不高于5 g和6 g，但目前我國人均每日食鹽攝入量在12 g左右[9-10]。而由食用肉制品而攝入的食鹽通常占居民攝入食鹽的20%～30%[11]。風干腸作為一種傳統發酵肉制品的代表，因其獨特的口感和風味而深受東北地區消費者的歡迎。但是為了保證產品的安全性及加工特性，在風干腸加工時通常加入2.5% NaCl，歷經發酵風干后的產品NaCl質量分數會高達3.3%～4.2%[1]。因此，降低風干腸NaCl含量的同時又可保證產品的品質及安全特性是亟需解決的問題。

目前減鹽策略主要包括4種：直接減鹽[1,12]、使用NaCl替代物和風味增強劑[13-14]、改變NaCl顆粒的大小和形態[15]以及使用非熱加工技術[16]，其中直接減鹽法相比與其他方法較為簡單直接，且符合天然、綠色和無添加的“清潔標簽”理念[17]，但該方法會影響食品原有的特征風味和食用期限。因此，在減鹽的同時盡量保證產品的品質特性至關重要。氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術是食品中常用的揮發性、半揮發性物質定性和定量方法；電子鼻和電子舌是仿生智能感官技術，主要用于食品中的氣味和滋味特征分析[18]。這些儀器具有靈敏度高、選擇性好和客觀準確等優點，三者相結合使用能夠實現對食品風味快速、準確和相補的分析效果，近年來已被應用到紅腸[19]、熏雞腿[20]、金鯧魚魚片[21]、烤咖啡豆[22]和蘋果[23]等多種食品的風味分析。因此，本研究運用智能感官技術結合GC-MS技術研究不同NaCl添加量（2.50%、2.00%、1.75%和1.50%）對風干腸的風味特征的影響，以期為減鹽風干腸的開發及品質提升提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬后臀肉、豬背脂、腸衣、食鹽、大曲酒、味素、淀粉、香辛料 市購；亞硝酸鈉（食品級） 天津市 福晨化學試劑廠；葡萄糖（食品級） 河南萬邦實業有限公司。

1.2 儀器與設備

JD500-2電子天平 沈陽龍騰電子稱量儀器有限 公司；AL-104精密電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）設備有限公司；DHG-9000電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；DELTA320 pH計 美國Mettler Toledo公司；HWS-70BX恒溫恒濕箱 天津市泰斯特儀器有限公司；GC-3L小型灌腸機 瑞安市鴻飛機械有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗儀器開發有限公司；SPX-250B-D型振蕩培養箱 上海博訊實業有限公司；AquaLab智能水分活度儀 美國Decagon Devices公司；SA402B電子舌 日本Insent公司；PEN3便攜式電子鼻氣味分析儀 德國Airsense公司；GCMS-QP2020單四極桿型氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 風干腸的制備

共有4 組風干腸處理組，其NaCl添加量分別為2.50%（對照組）、2.00%、1.75%和1.50%。參照Chen Qian等[24]的方法制作風干腸并部分改動，首先，將瘦肉和肥肉用孔徑為1.5 cm篩板的絞肉機絞碎，按瘦肥質量比9∶1混合。然后，加入0.01%亞硝酸鹽（以瘦肉質量計）、1%玉泉大曲、1%葡萄糖、0.3%味素、5%水和0.8%香辛料（主要包括花椒、橘皮、砂仁、小茴香和丁香等），并按照實驗設計加入相應的NaCl混勻。隨后灌入豬小腸衣，風干腸長度約15 cm，直徑約2.5 cm。然后在溫度為（25±2）℃、相對濕度為30%～50%的環境中風干24 h，隨后轉移到恒溫恒濕發酵箱中發酵11 d，溫度為（25±2）℃，相對濕度為65%～70%。分別在第0、3、6、9、12天進行取樣，測定其水分含量、aw、pH值、乳酸菌總數；在0 d和12 d測定電子鼻、電子舌以及揮發性物質含量，并在12 d對風干腸進行感官評價。

1.3.2 水分含量和aw的測定

水分含量的測定參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》中的直接干燥法；aw參考陳佳新等[1]的方法，取5 g肉樣鋪滿盒底，然后置于水分活度儀中測定。

1.3.3 pH值和乳酸菌總數的測定

取10.0 g肉樣，加入90.0 mL去離子水并振蕩混勻，靜置30 min后過濾，測定濾液的pH值。乳酸菌總數參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌測定檢驗》進行測定。

1.3.4 電子鼻的測定

取3.00 g碎肉樣于頂空瓶中密封，室溫下自然放置1 h使其內部揮發性風味物質平衡，隨后使用電子鼻進行測定。測定參數如下：采樣時間間隔1 s，預采樣時間5 s，自清洗時間100 s，歸零時間10 s，進量流量 300 mL/min，樣品測定時間90 s。電子鼻配有10個傳感器，能對相應敏感氣味物質產生響應：W1C（芳烴物質）、W5S（氮氧化合物）、W3C（氮類，芳香組分）、W6S（氫化物）、W5C（芳香烯烴，極性化合物）、W1S（烷類化合物）、W1W（硫化物）、W2S（醇類、醛酮類）、W2W（含硫有機物，芳香組分）和W3S（長鏈烷烴）。

1.3.5 電子舌的測定

參考Yin Xiaoyu等[19]的方法，并稍作改動。取25.0 g碎肉與125.0 mL去離子水混合并在40 ℃條件下水浴30 min，隨后絞肉機低速攪拌1 min，將混合物離心（5 000 r/min，10 min，4 ℃），取上清液過濾，然后對濾液進行電子舌分析。該儀器配有鮮味、澀味、咸味、酸味和苦味5個味覺傳感器以及兩個參比電極。

1.3.6 揮發性化合物的測定

參照Wen Rongxin等[25]的方法測定。取3.00 g碎肉樣和4.0 μL鄰二氯苯（內標物）置于頂空瓶，隨即密封，并置于45 ℃條件下平衡25 min。平衡后將萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）插入頂空瓶中萃取30 min（45 ℃），然后將萃取頭置于GC-MS進樣口熱解吸（3 min，230 ℃），并通過該儀器對揮發性物質進行分離鑒定。通過比較NIST 14質譜庫對揮發性化合物進行鑒定，取相似度大于85%的結果，采用內標法定量，結果以μg/kg表示。

1.3.7 感官評價

參考扈瑩瑩等[26]的方法，并作適當改動。選取10 名食品專業學生進行評定，將100 ℃熟制20 min的風干腸切成5 mm厚的薄片，通過雙盲法7 分制對風干腸評定，感官評價成員每次評定樣品前都要漱口。感官評定指標包括氣味（干腸特有氣味濃郁7 分；有異味或氣味不足1 分）、色澤（顏色鮮紅7 分；顏色暗淡1 分）、咸味（咸味過重7 分；基本無咸味1 分）、酸味（酸味過重7 分；基本無酸味1 分）、口感（質地干硬7 分；質地柔軟1 分）及總體可接受度（可接受性最佳7 分；可接受性最差1 分）。

1.4 數據處理

實驗進行3 次重復，每次實驗均選3個平行樣測定所有指標，結果以±s表示。數據統計分析采用Statistix 8.1軟件，顯著性分析使用Tukey HSD程序（P＜0.05，差異顯著），繪圖采用Origin 2019軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 NaCl添加量對風干腸水分含量及aw的影響

由圖1A可知，各組風干腸中水分含量隨著發酵的進行均呈降低趨勢（P＜0.05）。2.50%、2.00%、1.75%和1.50%處理組中水分質量分數經12 d發酵后分別降至18.53%、19.30%、19.43%和21.66%，這是由于風干腸在發酵過程中風干失水造成的。此外，同一發酵時間不同處理組中水分含量隨NaCl添加量的降低而呈不斷上升的趨勢。除3 d外，2.50%、2.00%和1.75%處理組間差異不顯著（P＞0.05），在發酵末期（12 d），1.50%處理組的水分含量均顯著大于其他處理組（P＜0.05）。由圖1B可知，不同處理組的aw變化趨勢與水分含量一致，但并不呈線性關系，與Chen Jiaxin等[27]的研究結果類似。在0 d，NaCl添加量為1.50%的處理組顯著高于其他處理組（P＜0.05）。隨著發酵的進行，aw不斷下降，發酵3 d后，對照組（2.50%）的aw顯著低于其他處理組 （P＜0.05），發酵6 d后，處理組的aw均在0.850以下，此時風干腸中大部分微生物和內源酶的活性受到抑制[28]。上述aw的變化主要受發酵過程中水分不斷散失以及aw抑制劑NaCl含量增加的影響[1,29]。

圖1 NaCl添加量對風干腸發酵過程中水分含量（A）和aw（B）的影響Fig. 1 Effects of different NaCl levels on the moisture content (A) and aw (B) of air-dry sausages during fermentation

2.2 NaCl添加量對風干腸pH值和乳酸菌總數的影響

由圖2A可知，在0 d各處理組的pH值在6.38左右，經過3 d的發酵，pH值迅速下降（P＜0.05），2.00%、1.75%和1.50%處理組的pH值均在5.50以下。pH值的降低對發酵肉制品很重要，不僅能夠抑制腐敗菌的生長[30]，而且對產品最終顏色和風味的形成也十分重要[2]。pH值在發酵3 d后趨于平穩，這可能與非蛋白氮以及氨基酸代謝的堿性產物積累有關[31]。除0 d外，處理組間的pH值隨NaCl添加量的減少而降低，對照組的pH值顯著高于其他處理組（P＜0.05），這可能是由于高含量的NaCl抑制了乳酸菌的生長[32]，而1.75%和1.50%處理組間差異不顯著（P＞0.05）。由圖2B可知，發酵初期乳酸菌總數在5.18～5.31（lg（CFU/g））之間，這些微生物主要來源于原料肉、調味料和加工環境等，隨發酵時間的延長，各處理組中乳酸菌總數先迅速增加，在3 d達到最大，隨后各處理組均呈降低趨勢。這可能是由于發酵環境不利所致，如供乳酸菌生長的碳水化合物不足，以及可利用的水分逐漸減少[30]。與此同時，腸體水分損失造成高含量的NaCl也可能對乳酸菌生長具有一定的抑制作用。此外，NaCl添加量對乳酸菌的生長具有明顯抑制作用，但在發酵末期不同處理組間差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 NaCl添加量對風干腸發酵過程中pH值（A）和 乳酸菌總數（B）的影響Fig. 2 Effects of different NaCl levels on the pH (A) and lactic acid bacterial count (B) of air-dried sausages during fermentation

2.3 NaCl添加量對風干腸滋味特征的影響

電子舌是一種仿生味覺分析儀器，能基于人工味覺傳感器陣列脂膜電勢的變化，客觀反映食品滋味的 變化[33]。由圖3A可知，經12 d發酵風干腸的滋味變化顯著（P＜0.05），其中酸味、澀味、苦味、鮮味、咸味增加，回味B（苦回味）和豐富度減少，回味A（澀回味）基本未變。這可能與發酵過程中水分減少，蛋白質、脂質和碳水化合物代謝以及微生物活動有關。0 d，隨NaCl添加量的降低，除咸味外，鮮味和澀味也逐漸降低 （P＜0.05），這可能與滋味間的相互作用有關；12 d，隨NaCl添加量的降低，酸味逐漸增加，這可能與乳酸菌代謝產生的有機酸有關。此外，咸味、鮮味和澀味隨NaCl添加量的降低而呈下降趨勢。這與Tian Xing等[34]的結論類似，研究發現在NaCl添加量為0%～5%的干腌豬肉中，咸味、鮮味和澀味隨NaCl添加量的減少而減少。由圖3B可知，主成分分析（principal component analysis，PCA）中，PC1和PC2的方差貢獻率分別為76.4%和12.6%，累計方差貢獻率為89%（＞85%），這表明前2個PC能反映有關樣本總體特征的許多信息[20]。0 d樣品分布在PC1負半軸，與豐富度和回味B相關，這表明0 d樣品中這2種味道貢獻較大，12 d樣品與其他味道相關，說明發酵結束后的風干腸中滋味更加復雜豐富。此外，可以明顯看出對照組（處于第1象限）與其他處理組（處于第4象限）的總體滋味相差較大，尤其是與1.50%處理組，而2.00%和1.75%處理組間的整體滋味最為接近。

圖3 不同NaCl添加量的風干腸基于電子舌的滋味分析（A）和PCA（B）Fig. 3 Taste assessment (A) and PCA plot (B) based on electronic tongue data of air-dried sausages with different NaCl levels

2.4 NaCl添加量對風干腸氣味特征的影響

電子鼻和電子舌的工作原理類似，是一種仿生嗅覺分析技術，可無損、快速和靈敏地實現對樣品中揮發性氣味信息進行全面評估[35]。由圖4A可知，傳感器W2W、W3S、W2S、W1W、W6S和W1S的響應值在0 d的樣品中較大，尤其是W6S、W1S和W2S，這說明0 d樣品中含有較多的含硫芳香有機物、長鏈烷烴和醇類等物質，其中W2S響應值較高可能與0 d風干腸中含有大量乙醇有關。傳感器W1C、W3C和W5C的響應值在發酵12 d的樣品中顯著增加（P＜0.05），這說明發酵12 d后，風干腸中含有大量芳香成分（芳烴物質和芳香氮類組分等物質），這與GC-MS的結果一致。另外，W5S在1.50%處理組中的響應值最大，這表明該處理組中含有較多的氮氧化合物。由圖4B可知，PC1和PC2的方差貢獻率分別為85.3%和12.1%，累計方差貢獻率為97.4%。0 d和12 d的處理組間的氣味相差較大，分別分布在PC1的正負兩軸。在發酵初期，處理組間整體氣味較為相近，這與6種傳感器（W2W、W3S、W2S、W1W、W6S和W1S）對應的揮發性氣味物質相關，而在發酵末期，處理組間差異較大，這與W5S、W1C、W3C和W5C傳感器對應的揮發性氣味物質相關，其中NaCl添加量為2.00%和1.75%的處理組相互靠近，這說明這2個處理組的整體氣味相近。

圖4 不同NaCl添加量的風干腸基于電子鼻的氣味分析（A）和PCA（B）Fig. 4 Odor radar plot (A) and PCA plot (B) based on electronic nose data of air-dried sausages with different NaCl levels

2.5 NaCl添加量對風干腸揮發性物質的影響

由表1可知，在風干腸中共檢出48種揮發性物質，包括醛類、酮類、醇類、酸類、酯類和萜烯類，這些化合物主要源于脂質氧化、蛋白質和碳水化合物分解代謝、細菌酯化反應、白酒和香辛料[36-37]。在風干腸中共檢測到4種醛類，己醛、壬醛和辛醛為常見的揮發性醛類物質，主要源于不飽和脂肪酸的自動氧化，由于其閾值較低且有明顯的脂肪香味，對發酵肉制品的風味形成具有重要貢獻[26]。隨著發酵的進行，這些化合物含量顯著增加（P＜0.05），在發酵末期，壬醛的含量最大，但不同處理組間多數醛類（除壬醛外）含量差異不顯著（P＞0.05）。通常而言，多數醇和酮類化合物源自碳水化合物代謝、脂質β-氧化和氨基酸分解代謝[32]，酮類相比其同分異構體的醛類閾值要高，而醇類（除不飽和醇外）的閾值也較高，因此它們對風干腸的整體風味貢獻相對較小[26]。酮類物質中甲基酮（2-壬酮）源于微生物對不飽和脂肪酸的β-氧化，是發酵香腸的特征發酵風味物質[38]，其在不同處理組間差異不顯著（P＞0.05）。對于醇類而言，由于風干腸在制作時添加了1%的白酒，因此乙醇在0 d時含量最大。但發酵12 d后其含量顯著降低（P＜0.05），這可能是發酵過程中乙醇參與了乙酯類化合物的形成。同時，在發酵末期，乙醇含量隨NaCl添加量的降低而顯著增加（P＜0.05），這可能與風干腸中乳酸菌的數量有關，發酵過程中，乙醇主要源于乳酸菌對碳水化合物的發酵作用[32]。此外，2,3-丁二醇是由碳水化合物代謝形成的，具有典型奶油氣味[39]，經發酵后產生，其含量隨著NaCl添加量的降低而呈現降低趨勢 （P＜0.05）；而2-庚醇和辛醇呈相反的趨勢，其可在乳酸菌作用下由某些氨基酸轉化形成[40]，另外，苯乙醇呈玫瑰味，由微生物代謝苯丙氨酸產生[41]，但在不同處理組間未呈明顯的變化趨勢。酸類物質在0 d時僅有己酸被檢測出，但隨著發酵的進行有大量酸類物質產生。其中乙酸和丁酸主要源于乳酸菌對糖類物質的代謝，因此在低鹽處理組中有大量的檢出，這些物質氣味閾值低，對發酵風味影響較大。其他酸類物質（如己酸、辛酸和壬酸）則由脂質氧化產生[4,42]，其中除壬酸和癸酸外，處理組間差異不顯著（P＜0.05）。酯類共檢出6種，多數都具有果香或酒香，對風干腸的最終風味貢獻很大，其主要來源于醇類與酸類間的酯化反應、在轉移酶作用下由乙酰輔酶A和高級醇為底物形成以及原材料的大曲酒[37]。相比于0 d，12 d的處理組中酯類種類和含量顯著增加（P＜0.05），且多數（除乙酸乙酯和癸酸乙酯）在較高NaCl添加量的處理組中含量較高，這可能與較高NaCl含量風干腸中細菌酯化活性更強有關[32]。此外，風干腸中檢測到大量源于香辛料的風味物質（如反式肉桂醛、小茴香酮、香葉醇以及萜烯化合物），這些風味物質在發酵過程中隨著風干的進行，含量顯著增加（P＜0.05），且整體而言在高鹽處理組中含量較高，這可能與其中的水分含量有關。

表1 不同NaCl添加量的風干腸在發酵過程中揮發性化合物含量的變化Table 1 Changes in volatile compound contents of air-dried sausages with different NaCl levels during fermentation μg/kg

續表1 μg/kg

2.6 NaCl添加量對風干腸感官評價的影響

如圖5所示，NaCl可通過影響水分含量以及蛋白質和脂質氧化間接影響產品的顏色，但不同NaCl添加量風干腸的色澤差異不顯著（P＞0.05），這可能與熟制風干腸中肌紅蛋白受熱變性呈灰褐色有關[43]。另外，口感和氣味在處理組間差異亦不顯著（P＞0.05）。對于咸味和酸味而言，降低NaCl添加量顯著降低了風干腸的咸味，提升了酸味（P＜0.05），這與電子舌的結果一致。在NaCl添加量為2.00%時，風干腸咸度適中，具備風干腸“咸香”的特征。就總體可接受性而言，NaCl添加量為1.75%和2.00%的風干腸得分最高（P＞0.05），但NaCl添加量為1.75%的風干腸咸度稍有不足。

圖5 不同NaCl添加量風干腸的感官評定Fig. 5 Sensory evaluation of air-dried sausages with different NaCl levels

3 結 論

本研究基于智能感官和GC-MS聯用技術分析不同NaCl添加量對風干腸風味特征的影響。結果表明，減少NaCl添加量增加了風干腸的水分含量、aw和乳酸菌總數，降低了pH值。電子鼻和電子舌結果表明，NaCl添加量為2.00%和1.75%的風干腸整體氣味和滋味最為相近。此外，降低NaCl添加量會促進源于碳水化合物代謝的揮發性化合物的形成，而降低源于酯化反應的揮發性化合物的形成。感官評價結果表明，NaCl添加量為2.00%和1.75%的風干腸總體可接受性最高，但后者風干腸“咸香”特征稍有不足?；诒狙芯靠梢詫L干腸中NaCl添加量降低20%～30%，在后續研究中仍需考慮低鹽風干腸的微生物特性及安全性，同時協同“增咸”技術提高NaCl添加量為1.75%風干腸的咸味，為低鹽風干腸的研發提供基礎。