良惡性胸腔積液中mRNA表達譜分析

彭丹 侯子亮 王愛麗 王金祥

胸腔積液是臨床常見疾病，研究發現[1]42%～77%的胸腔積液是惡性胸腔積液，其中1/3以上的是肺癌胸膜轉移。超過半數的惡性胸腔積液患者在診斷后6個月內死亡[2]，惡性胸腔積液的早期診斷和治有助于療改善預后。但是，現有的診斷技術如胸水細胞學檢查，難以鑒別惡性細胞和反應性間皮細胞，細胞學檢查僅能鑒別40%的惡性胸腔積液[3]。研究提示[4-5]癌胚抗原(carcinoembryonic antigen ，CEA)和 細胞角蛋白19片段(Cyfra21-1)診斷惡性胸腔積液的敏感性較高，但其假陽性率又會削弱它的診斷效能。目前尚無有效的生物標記物鑒別良性及惡性胸腔積液，并且對于惡性胸腔積液的形成機制尚不明確。mRNA是由DNA的一條鏈作為模板轉錄而來，攜帶遺傳信息，并能指導蛋白質合成，mRNA參與多種生物學過程，并且參與腫瘤的發生發展。我們在前期研究中[6]發現良惡性胸腔積液中有大量差異表達的mRNA，惡性胸腔積液沉淀物中相關的mRNA可能參與惡性胸腔積液的發生機制。本研究分析良惡性胸腔積液中差異mRNA，篩選出關鍵mRNA，并通過分析探索可能參與的調節機制。

資料與方法

一、一般資料

本研究符合《赫爾辛基宣言》的原則，我們收集首都醫科大學附屬北京潞河醫院2018年1月至2018年12月收治的胸腔積液患者6例，均簽署知情同意書，其中3例經胸膜活檢或胸腔積液病理證實為肺腺癌患者，另3例胸水涂片鏡檢或PCR檢測確診為結核性胸膜炎，在樣本采集時所有患者未接受任何抗腫瘤、抗結核治療。

二、研究方法

標本處理：患者入院24小時內采用標準胸腔穿刺術抽取胸腔積液，10mL胸腔積液置于經肝素抗凝的離心管中，1200rpm離心5分鐘，棄上清，留取沉淀物，使用TRIzol (Invitrogen, NY, USA)重懸沉淀物，按照廠家說明書提取總RNA，-80°冰箱保存。

mRNA芯片檢測：首先對樣品中總mRNA進行質控，采用Qubit 3.0 Fluorometer對微量RNA濃度進行精確定量，進行進一步基因芯片檢測。將片段化標記后的樣品加入對應型號芯片，放入GeneChip Hybridization Oven 645雜交爐，到達指定時長后使用基因芯片洗脫工作站GeneChip Fluidics Station 450按對應Protocol進行洗染，使用3000 7G的基因芯片掃描儀(Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)對陣列進行掃描。掃描儀通過捕獲熒光信號獲得每個探針的信號值，生成CEL文件。使用R軟件包(R version 3.4.4)進行原始數據數歸一化和標準化處理，再對所有mRNA進行差異表達分析，得到差異表達的mRNA。

差異表達mRNA功能分析及關鍵mRNA選擇：我們在DAVID(Annotation, Visualization and Integrated Discovery https://david.ncifcrf.gov/)網站進行GO(gene ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，對差異mRNA進行功能注釋和分類，構建蛋白互作網絡關系圖，并篩選出前20名的關鍵mRNA，找到基因間相互關系。在oncomine(https://www.oncomine.org/resource/login.html)中驗證該20個mRNA在肺癌中的表達差異，提取出同時在oncomine中具有表達差異的mRNA，分析其在肺癌中與患者生存的關系。

三、統計方法

我們采用 R (http://www.bioconductor.org/)軟件中的“gcrma”包對基因芯片CEL文件進行歸一化和標準化處理。再使用“limma”包對所得到的數據進行差異表達分析。良惡性胸腔積液中的差異表達mRNA根據t檢驗的方法，設定FC(fold-change)≥2且p≤0.05為統計學差異。前期研究中[6]通過聚類分析顯示兩組標本間mRNA表達譜的差異。并采用火山圖的方式展現出兩組差異表達的mRNA。使用Cytoscape繪制蛋白互作網絡關系圖。使用在線工具http://gepia.cancer-pku.cn/對有差異的基因進行生存分析。

結 果

一、良惡性胸腔積液患者一般資料比較

我們收集6例胸腔積液患者入組，其中3例為肺腺癌合并胸膜轉移，3例為結核性胸腔積液，所有患者均經組織病理學確診。6例患者的人口學特征(見表1)。

表1 入組患者的人口學特征

二、兩組患者中差異表達的mRNA及GO、KEGG分析

基因芯片(Clariom D Human Array)用于檢測良惡性胸腔積液mRNA表達譜。經統計分析，共得到差異表達的mRNA1716個，其中上調mRNA1098個，下調mRNA618個(FC≥2.0 and p < 0.05)。前期研究[6]中對差異表達的mRNA進行GO富集分析發現，所有差異表達的mRNA生物學過程主要集中在細胞遷移、信號轉導、細胞黏附、T細胞活化、細胞表面受體信號通路等；其所參與的細胞組分，主要有細胞外外泌體、漿膜、原生質膜的組成部分、細胞表面、黏著斑等；另外其參與的分子功能多集中在蛋白結合、肌動蛋白絲綁定、整合素結合、鈣粘蛋白結合及細胞粘附、細胞黏附分子結合等。KEGG分析提示差異mRNA功能，主要集中在以下信號通路：腫瘤信號通路、細胞外基質受體相互作用、細胞黏附分子、PI3K-Akt信號通路、Rap1信號通路、腫瘤中的蛋白聚糖、黏著斑、T細胞受體信號通路等。

三、構建蛋白互作網絡，篩選關鍵基因：我們利用DAVID網站對差異表達mRNA構建蛋白互作網絡關系圖(圖1)，并篩選出前20個關鍵基因：APP、CKAP4、LAMB1、LAMC1、SDC2、GPC3、APLP2、RCN1、WFS1、BMP4、SPP1、MSLN、IGFBP3、F5、CSF1、CALU、IGFBP7、CYR61、GOLM1、PDIA6，相互關系圖(圖2)。其中LAMC1、SPP1、IGFBP3、F5四個基因參與不同KEGG通路(表2)。我們目前無大樣本臨床資料及胸水標本進行生存分析，考慮我們所收錄的惡性胸腔積液均為肺癌胸膜轉移，故我們在http://gepia.cancer-pku.cn/網站利用肺癌數據對該4個基因做生存分析，結果顯示該4個基因的生存曲線均有統計學差異(圖3)，3個上調基因(LAMC1、SPP1、IGFBP3)的高表達及下調基因F5的高表達提示較短的生存時間，預后不良。

圖1 差異表達mRNA蛋白互作網絡關系圖

圖2 關鍵mRNA蛋白互作網絡關系圖

表2 關鍵mRNA參與的KEGG信號通路

圖3 LAMC1(A)、SPP1(B)、IGFBP3(C)、F5(D)在肺癌患者中的生存曲線LAMC1、SPP1、IGFBP3、F5在肺癌患者中高表達和低表達總生存時間比較

討 論

胸腔積液是臨床上常見的疾病，在肺癌中常常以首發癥狀出現，合并胸腔積液多提示III～IV期肺癌[7]。胸腔積液的診斷首先依據Light氏標準和胸水生化等明確胸水性質為滲出液還是漏出液，如果是滲出液，則需進一步完善胸水腫瘤系列、胸水沉淀病理以及微生物檢測等鑒別良惡性胸腔積液，對一些難以鑒別的胸腔積液，甚至需要行胸腔鏡胸膜活檢術明確。整個診斷過程耗時、耗力，因此臨床上需要靈敏性及特異性更高的生物標志物鑒別良惡性胸腔積液。對于惡性胸腔積液的治療在臨床上仍然是個難點，在分子層面探索胸腔積液的生成機制，為胸腔積液的治療提供有利的線索。在我們的研究中發現LAMC1、SPP1、IGFBP3、F5與肺癌患者的預后相關，本文重點分析了LAMC1、SPP1在惡性胸腔積液中的作用。

LAMC1(laminin γ1)是層黏連蛋白家族中的一員，是腫瘤微環境中一部分，調節細胞外基質，參與細胞的分化、遷移、粘附[8]。已有研究[9-11]顯示LAMC1在腦膜瘤細胞、前列腺癌、子宮癌等多種腫瘤中表達增高，促進癌細胞的轉移。Ye GuanXiong[12]等研究發現LAMC1下調使 AKT通路失活從而調節PKM2的表達，進而抑制肝癌細胞轉移和Warburg效應。目前LAMC1對肺癌的影響鮮有報道，本研究中發現惡性胸腔積液中LAMC1明顯升高，我們推測LAMC1同樣影響著惡性胸腔積液的進展及預后。

分泌性磷蛋白(secreted phosphoprotein l，SPP1)是一種分泌性磷酸化糖蛋白，屬于細胞外基質(extracell matrix，ECM)，該蛋白參與破骨細胞粘附于骨礦化基質的過程，可促進細胞的黏附和遷移，大量研究證實[13-14]spp1在多種浸潤性癌中發揮重要作用，如乳腺癌、肺癌、胃癌、結直腸癌等。一項989例NSCLC的研究[15]顯示SPP1過表達與NSCLC預后不良有相關性。另一項研究亦揭示SPP1可促進小細胞肺癌的增殖活力，抑制凋亡和自噬[16]。有實驗檢測了腫瘤和宿主來源的SPP1在MPE形成中的影響，結果發現SPP1在惡性胸腔積液中起到以下重要作用，SPP1協同促進胸膜積液和胸膜內癌擴散; SPP1還可以產生血管內皮生長因子非依賴性高通透性作用; 宿主SPP1誘導巨噬細胞進入胸膜轉移瘤內并促進腫瘤血管生成，而腫瘤SPP1在體內抑制癌細胞凋亡; 腫瘤和宿主SPP1通過不同途徑影響胸膜TNF、基質金屬蛋白酶-2、IL-6含量，此外 SPP1還可以激活肺癌細胞中的NF-kB通路[17]。有研究使用ELISA檢測良惡性胸腔積液中的SPP1表達水平，發現惡性胸腔積液中SPP1表達明顯升高，胸腔積液中SPP1表達量診斷MPE的準確性為71.5%(95%CI：64%～80%)，我們試驗中采用基因芯片技術同樣檢測到惡性胸腔積液中SPP1表達水平明顯高于良性胸腔積液，證實了SPP1參與惡性胸腔積液的發生、發展。

在我們的試驗中發現多種mRNA存在表達差異，其中最為顯著且在肺癌中與生存相關的mRNA有LAMC1、SPP1、IGFBP3、F5，其他研究中也發現LAMC1、SPP1在惡性腫瘤中存在表達差異，尤其是SPP1在多項研究中發現惡性胸腔積液中表達水平明顯增高，作為診斷指標可以提高惡性胸腔積液診斷準確性，我們的研究中，入組樣本量偏少，且入組樣本都是肺腺癌胸膜轉移合并惡性胸腔積液，不能覆蓋肺癌其他病理類型，在后續研究中增大樣本量，重點研究上述4個mRNA的表達水平，根據大樣本數據可以聯合多項指標通過簡便快速的方法診斷出惡性胸腔積液。