生物標志物用于鑒別診斷肺結節性質的研究進展

杜孝敬 馬禮兵

孤立性肺結節(solitary pulmonary nodule，SPN)是直徑≤3cm，肺內孤立存在的，圓形或者類圓形的非透明病灶，結節是完全由肺實質所包圍，沒有肺門或縱隔淋巴結腫大、肺不張及胸腔積液[1]。隨著胸部CT在臨床實踐中的日益普及，越來越多的人被發現孤立性肺結節。美國國家肺部篩查試驗(NLST)表明，采用低劑量CT對高危人群肺癌的篩查可降低死亡率[2]。然而，低劑量CT缺乏區分早期惡性腫瘤和良性結節的準確性，導致假陽性率很高(96.4%)[2-3]。近年來氟代脫氧葡萄糖(18F-flurodeoxyglucose,18F-FDG)PET/CT用于孤立性肺結節的鑒別診斷，其診斷價值得到了廣泛的認可[4]；研究顯示[5-6]，對于直徑>8mm的孤立性肺結節，最大標準攝取值(SUVmax)用于診斷孤立性肺結節得到了極大的肯定,但對于直徑較小的孤立性肺結節，其診斷性能仍沒有較多的文獻數據支持?，F國內外手術及介入處置的時機仍沒有很好的評判標準，依靠多學科協作診療可能是目前最適宜的方式。一項研究顯示，在肺癌患者中，細針抽吸活檢樣本的質量或數量往往很低，高達25%的活檢無法獲得足夠的組織進行評估[7]。一些腫瘤標志物包括神經元特異性烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原(CEA)、鱗狀細胞癌抗原(SCCA)和細胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)已被廣泛應用于臨床。但是，這些腫瘤標志物對于區分良惡性肺結節的特異性和敏感性是有限的。且影像學檢查往往具有滯后性以及放射線輻射危害。因此，這證明有必要探索新的診斷工具，例如生物標志物，作為鑒別孤立性肺結節性質的非侵入性方法。

生物標志物

一、肺癌七種自身抗體標記物

腫瘤抗原可以啟動宿主免疫應答，產生與腫瘤抗原相關自身抗體，這些抗體已被發現在疾病出現癥狀之前就已存在[8-9]。因此，對于早期肺癌的檢測具有診斷價值[10]。研究表明，自身抗體用于區分良惡性肺結節時，其敏感性為56.53%，特異性為91.60%，當與CT結合時，特異性可以進一步提高到95.80%[11]。ChapmanC.J.等人[12]首次將肺癌七種自身抗體聯合用于肺癌的檢測, 單項抗體檢測的陽性率為5%～36%，特異性為96% ～100%，而聯合檢測陽性率76%，特異性為92%。一項國內大規模、多中心性研究，肺癌七種自身抗體抑癌基因53(P53)、蛋白基因產物9.5(PGP9.5)、性別決定基因家族2(SOX2)、腫瘤/睪丸抗原G抗原7(GAGE7)、ATP結合RNA解旋酶(GBU4-5)、黑色素瘤抗原A1(MAGEA1)、腫瘤相關基因(CAGE)用于肺癌早期的診斷，其敏感性為61%，特異性為90%，同時也驗證了與單獨使用 CT 掃描相比，聯合使用，可使診斷肺結節的準確率提高到 89.1%[13]。一項Logistic回歸研究顯示，在早期肺癌中，這七個自身抗體的組合檢測比任何單個自身抗體的檢測更可靠(敏感性：47.8%；特異性：81.4%)[14]。一項系統性回顧分析，也證明了測定血清或血漿中的自身抗體可用于早期肺癌檢測的生物標志物[15]。目前有研究提出，痰液中的自身抗體的敏感性可能比血清或血漿中自身抗體的敏感性高，更加利于早期肺癌的檢測。Li N.等人的一項研究中開發了痰液中自身抗體(DDX6、ENO1和14-3-3ζ)作為生物標志物，其診斷肺癌的敏感性為81%，特異性為83%，可用于檢測早期肺癌，但其診斷價值及臨床意義后續需要更多的研究來驗證[16]?？梢姺伟┢叻N自身抗體標記物作為一種新興的生物標志物用于孤立性肺結節和早期肺癌的鑒別，具有一定的臨床應用價值。

二、DNA甲基化

DNA甲基化是多種生物學過程和疾病中的主要表觀遺傳修飾之一，特別是在腫瘤的發生過程中[17]。DNA甲基化的改變通常發生在癌癥的早期階段[18]。近年來，隨著DNA甲基化的分析技術和臨床轉化研究的突破，DNA甲基化檢測可以作為一種早期篩查和診斷腫瘤的新技術。一項基于矮小同源盒(SHOX2)基因、前列腺素E受體(PTGER4)基因DNA甲基化與傳統腫瘤標志物(NSE、CEA、CYFRA21-1)對良性和惡性肺結節的鑒別診斷研究，SHOX2、PTGER4和總甲基化的曲線下面積(AUC)遠高于傳統的血清標志物，其診斷性能優于傳統的血清參數[19]。LiM.[20]等聯合了三個甲基化標記，即cg08032924(CMTM2)、cg14823851(TBX4)和cg19161124(DPP6)，得出了這三種標記物在區分肺腺癌和正常組織樣本方面可以達到極高的敏感性和特異性，并且這三個標志物在I期腫瘤中均顯著超甲基化(Mann-WhitneyP值<0.0001)。在最近一項歐洲和中國肺癌病例對照研究中，結合6個甲基化標記物的血液檢測(Lung EpiCheck)，其能檢測到高比例的早期肺癌，并在加入已確定的危險因素(年齡、吸煙、慢性阻塞性肺疾病等)后顯著提高了預測的準確性[21]。因此，DNA甲基化這種非侵襲性的檢查方法，展現了良好的應用前景。

三、循環腫瘤DNA

循環腫瘤DNA(ctDNA)是壞死的腫瘤細胞釋放到血液中的DNA[22]。近年來，隨著基因測序技術的快速發展，ctDNA得到了廣泛的關注。許多研究似乎對ctDNA在治療監測方面特別有吸引力，而在早期癌癥診斷和篩查方面的潛力，才剛剛開始探索。ctDNA作為腫瘤晚期的生物標記物的價值已經得到很好的證實[23]。但是，其在早期肺癌檢測中的價值仍未確定[24]。有研究顯示，與傳統的組織活檢相比，血液中ctDNA對肺癌的診斷敏感性可達到75%，特異性達到89%[25]。此結果表明，在早期肺癌患者的血液中檢測突變的ctDNA是有可能性的。盡管ctDNA分析為早期肺癌診斷提供了可行的選擇，但現有技術對敏感性分析的困難仍難以克服。而開發下一代測序(NGS)技術可能會提高這方面的敏感性。ctDNA對癌癥早期診斷的潛力是一個值得關注的領域，在應用于臨床之前，還需要進一步的技術開發和更大規模的循證研究。

四、循環腫瘤細胞

循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)是從原發腫瘤或轉移瘤中分離出來進入外周血的腫瘤細胞。在過去的二十年里，無論是在局部還是在轉移的情況下，CTC的預后價值已經在最常見的腫瘤類型中得到了明確的證明[26]。然而，它們在對惡性腫瘤的診斷作用仍有待確定，尤其是對惡性腫瘤的早期鑒別作用。幾項研究已經在腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤發展的早期階段發現了CTC[27-29]。而CTC用于診斷早期肺癌相關研究也有顯著發現。2014年Ilie等人報道稱[30]，在患有慢性阻塞性肺疾病的肺癌患者中，利用上皮腫瘤細胞大小分離技術(ISET)檢測CTC的存在，發現CTC比在CT掃描中發現惡性腫瘤的放射征兆早1～4年。而近期的一項前瞻性、多中心隊列關于使用ISET技術的檢測CTC在肺癌篩查的研究中得出，CTC檢測對肺癌檢測的敏感性為23.6%[31]。這可能與早期肺癌患者血液中CTC的數量少有關。另外，有研究首次利用CellCollector技術檢測體內CTC對早期肺癌診斷的敏感性和特異性分別為52.94%和90%，用CTC計數區分良惡性結節的ROC曲線下面積為0.715 (P=0.041)[32]。結果表明，體內捕獲的CTC可用于早期肺癌的有效診斷。然而，既往使用CellSearch系統診斷早期肺癌的研究顯示，體外捕獲的CTC不能有效區分良惡性結節[33]。這一結果可能是體外檢測技術靈敏度低的結果。目前，CTC用于早期肺癌篩查的證據仍不足，隨著更好的CTC分離技術的發展和大型前瞻性試驗中的臨床測試，CTC的臨床效用有望提高。

五、微小RNA(miRNA)

血漿miRNA在肺癌的發生和發展過程中起著關鍵作用[34]。許多研究表明，miRNA對早期癌癥檢測具有很高的診斷效率[35-36]。在兩個大型的意大利回顧性研究中，使用miRNA特征分類器(MSC)和miR-Test可以使低劑量CT假陽性率降低四到五倍，而特異性(75%～81%)和敏感性(78%～87%)相當[37-38]。且相比于單個miRNA，多個miRNA組合診斷效率更高[39]。研究顯示，早期非小細胞肺癌患者中miRNA-146a、-200b和-7的表達水平明顯高于良性結節患者，并使用這三個miRNA和CT特征建立了早期非小細胞肺癌的預測模型，敏感性和特異性分別為92.9%、83.3%，表明這三個miRNA可能是肺癌早期診斷的潛在生物標志物[40]。也有一些基于痰液miRNA的研究為診斷惡性肺結節帶來新希望，XieY.等首次證明內源性miRNA具有抗凍融作用，并且穩定存在于痰液中[41]。一項研究提出，痰液中miRs-21、31和210這三種miRNA生物標志物，可以區分早期非小細胞肺癌與良性孤立性肺結節，敏感性為82.93%，特異性為87.84%[42]。最近的一項研究顯示，聯合痰液和血漿miRNA檢測比單獨使用時具有更高的準確性，體現了不同體液中的生物標志物將協同改善非小細胞肺癌的早期檢測，但目前這項研究尚無來自小細胞肺癌患者的標本，生物標記物對早期檢測小細胞肺癌的診斷潛力仍然未知[43]。針對惡性程度較高的小細胞肺癌來說，可能更應該結合多種方式進行前瞻性的研究。

展望與總結

生物標志物的發現為肺結節患者帶來了新希望。肺癌七種自身抗體標記物、DNA甲基化、循環腫瘤DNA、循環腫瘤細胞、miRNA等這些標志物作為一種快速、方便且無創的方法，未來廣泛應用于臨床，幫助臨床醫生以個性化的方式管理患者。聯合臨床、生物學和放射學等多學科協助鑒別孤立性肺結節的性質，提高早期肺癌診斷的特異性和敏感性，從而實現對肺癌的早發現、早治療，并最終改善肺癌的預后。