呼吸重癥監護室耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分子流行病學調查

曾軍 孟千琳 李奇 馬春蘭 鄭鵬城 李萬成

金黃色葡萄球菌是一種最常見臨床致病菌，常引起社區獲得性或醫院獲得性感染，自耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)發現以來，由其引起的感染迅速在全球流行[1]。近年來，雖然MRSA檢出率表現出逐漸下降趨勢，但仍然是最主要的一類耐藥致病菌。

感染是ICU患者最常見并發癥，也是發展為膿毒癥的必需因素；據EPIC III報道，約57%的ICU患者合并有可疑或確診感染，感染后病死率達到30%，其中MRSA是最常見的耐藥致病菌之一[2]。

因此，對醫院RICU病房MRSA感染的耐藥特征、分子分型調查和分析，有助于提供針對性的治療策略，提高RICU病房病人的臨床預后，現將本文研究結果報告如下。

資料與方法

一、材料

取成都醫學院第一附屬醫院RICU病房2017年1月至2020年12月自病人的痰標本、肺泡灌洗液、血液、尿液等標本中分離出的52株MRSA作為受試對象，均符合MRSA感染診斷標準《醫院感染診斷標準(試行)》[3]。本研究經成都醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會審查批準。

二、細菌分離及鑒定

先通過VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定藥敏分析儀鑒定為金黃色葡萄球菌，質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923。MRSA的鑒定采用頭孢西丁紙片擴散法，參照美國臨床與實驗室標準協會(CLSI)M100-S30 文件執行。

三、藥敏實驗

采用瓊脂稀釋法：將0.5麥氏濁度單位的菌懸液，用CAMHB肉湯將初始接種物1 ∶100倍稀，菌液濃度約為1×106 CFU/mL，用多點接種儀吸取0.05 mL接種于含系列稀釋抗菌藥物CAMHB肉湯，35℃孵育16～20h后觀察結果，計算抗菌藥物MIC50、MIC90。藥敏結果判斷參照美國CLSI M100-S30判斷標準，所用15種抗生素包括苯唑西林、頭孢唑林、呋喃妥因、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑(復方新諾明), 紅霉素、克林霉素、利福平、利奈唑胺、慶大霉素、四環素、替加環素、替考拉寧、萬古霉素、左氧氟沙星、莫西沙星。

四、分型檢測方法

多位點序列分型(MLST)聯合SCCmec分型方法進行分子分型。使用PubMLST數據庫網站(https://pubmlst.org/)推薦引物，PCR擴增7個管家基因(arc C、aro E、glp F、gmk、pta、tpi和yqi)，擴增片段送生工生物測序，測序結果登錄PubMLST數據庫經過序列比對，以獲取等位基因號，最終確定MLST分型。SCCmec基因分型使用5對特異性引物，對每株MRSA基因組DNA進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增產物，鑒定五種類型(I、II、III、IV、V), 其余判定為未定型(NT),具體方法參考文獻[4-5]。

五、統計學方法

結 果

一、標本來源

30.76% MRSA標本來源中痰標本，占比最高；21.15%來源于肺泡灌洗液。呼吸系統是MRSA的主要來源，其余來源(見表1)。

表1 RICU病房52株MRSA標本來源

二、藥敏試驗結果統計

MRSA對苯唑西林、頭孢唑林及紅霉素的耐藥率高，分別達到100.00%、100.00%及84.62%；對克林霉素、四環素、左氧氟沙星的耐藥率較高，分別為48.08%、28.85%及和32.69%；其次為甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、慶大霉素、莫西沙星，耐藥率分別為13.46%、15.38%及17.31%。暫未發現對利奈唑胺、替加環素、替考拉寧及對照組萬古霉素耐藥株(見表2)。

表2 52株MRSA的抗菌藥物藥敏實驗結果

三、MLST分型結果

52株MRSA分屬為13個MLST型，其中主要為ST59(21株，40.38%)及ST5(14株，26.92%)；共鑒定出5種SCCmec型，主要為IV型(36株，69.23%)及III型(10株，19.23%)(見表3)。

表3 MLST及SCCmec分型結果

討 論

金黃色葡萄球菌可采用脈沖場凝膠電泳(PFGE)、多位點序列分型(MLST)、SCCmec等多種技術進行分型鑒定[4]。PFGE為限制性核酸內切酶多態性分型技術，作為細菌分型性檢測的“金標準”，可用于研究同種菌株間的同源性、分子流行病學研究等[6]。然而，細菌在進化過程中會隨機發生各種點突變、基因片段缺失或插入等遺傳變異，造成目的基因酶切位點在空間分布或/和數量上發生改變，進而造成同一菌株其PFGE電泳圖譜呈現多樣性；并且，PFGE的結果判讀有較強的主觀性，有作者認為同一電泳圖譜的解讀可能不盡相同，影響解讀結果[7]。MLST分型技術基于7個管家基因，因其核酸序列進化上保守，良好的延續性確保了較高的菌株分辨力。并且，測序結果客觀，因此其對菌株的分型更加準確，更廣泛被應用[8-9]。

MRSA是臨床常見的耐藥菌，常引起重癥肺炎、導管內感染、皮膚軟組織感染、膿毒癥或膿毒癥休克等嚴重的感染性疾病，對其耐藥性分析及分型鑒定一直是醫院感染病研究工作重點。本次提取樣本的實驗分析顯示，我院RICU病房MRSA菌株主要來自呼吸道分泌物，其次為血液、胸腔引流液、皮膚軟組織、尿液與腹腔引流液，與文獻報道較為相符[10]。

本研究結果表明MRSA具有多重耐藥特征，對β-內酰胺類抗菌藥物高度耐藥，對大環內酯類、四環素類、磺胺類、氨基糖苷類與喹諾酮類等抗菌藥物都表現出不同程度的耐藥，僅有噁唑烷酮類、糖肽類、甘氨酰四環素類抗生素表現出高度敏感性。對苯唑西林、頭孢唑林完全耐藥；紅霉素耐藥率高達84.62%；第三代喹諾酮類藥物左氧氟沙星和莫西沙星耐藥率分別為32.69%和17.31%；甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、慶大霉素耐藥率分別為13.46%及15.38%，耐藥率相對較低。治療MRSA 感染的一線藥物可選擇萬古霉素、利奈唑胺或替加環素等，其中萬古霉素是治療MRSA 感染的首選藥物[11]。雖然達托霉素已被證實對MRSA 感染有良好的治療效果，但在肺部無抗菌活性，故不作為肺部MRSA感染治療常規抗菌藥。其他部位MRSA感染可考慮使用達托霉素，但其存在費用高昂，臨床用藥經驗缺乏等問題[12]。

由于MRSA的耐藥性存在區域差異，MRSA感染經驗治療的抗生素選擇需根據不同區域MRSA的耐藥模式、感染部位、藥物可選擇性、藥物不良反應等因素決定[13]。臨床應用主要根據藥敏試驗結果決定聯合用藥模式，并重視抗菌藥物管理，改善MRSA感染治療結局并減少耐藥性產生。