血清KL-6水平在原發性干燥綜合征繼發間質性肺病患者診斷及病情評估中的作用

張君 王方萍 石沈云 桂賢華 曹敏 姜涵毅 劉銳敏 蔡后榮 丁晶晶

原發性干燥綜合征(primary Sjogren’s syndrome, pSS)是一種慢性系統性自身免疫性疾病，多發于中年女性，臨床以口、眼干燥、腮腺腫脹為常見癥狀，但有約1/3的患者存在腺體外表現：包括嚴重疲勞、廣泛的肌肉骨骼疼痛、多關節炎、肌痛、血管炎、腎炎、肺部受累等[1-2]。在原發性干燥綜合征中，呼吸系統受累主要包括小氣道疾病、間質性肺病(Interstitial lung disease, ILD)、肺動脈高壓、肺淋巴瘤、胸膜病變、肺淀粉樣變等，其中ILD是pSS最常見及嚴重的肺部并發癥之一[3-4]。涎液化糖鏈抗-6(Krebs von den Lungen-6，KL-6)主要由增殖的、受激發或受損的II型肺泡上皮細胞分泌，KL-6水平能反應肺泡上皮和間質的損傷程度。本研究通過分析pSS-ILD患者的臨床表現、實驗室檢查、影像學特點，了解該疾病的臨床特征，并通過檢測患者血清KL-6、IL-4、SP-D和TGF-β表達水平，探討血清學標志物在pSS-ILD疾病診斷和病情嚴重程度評估中的作用。

資料與方法

一、一般資料

收集2013年5月至2014年5月在南京大學醫學院附屬鼓樓醫院呼吸與危重癥醫學科經多學科討論后明確診斷為pSS-ILD住院患者的臨床資料，共31例作為研究組。選取同期40例臨床資料完整的患者作為對照組，其中27例肺炎患者，另外，選取無呼吸道癥狀、影像學檢查正常、年齡、性別、身體質量指數匹配的健康體檢者作為健康對照，共13例(P均>0.05)，年齡、性別和身體質量指數以上差異無統計學意義(見表1)。ILD結合臨床、影像學、肺功能綜合診斷，參照ATS/ERS制定的2013年版國際多學科間質性肺病的分類標準[5]。原發性干燥綜合征診斷依據參照2016年ACR/EULAR-ACR pSS分類標準[6]。

表1 兩組研究對象基礎資料對比

二、 臨床資料

收集臨床資料包括性別、年齡、基礎疾病、口干眼干、口腔潰瘍、關節痛、咳嗽氣喘、肺部捻發音或爆裂音、血常規、生化、免疫常規、免疫抗體、血淋巴細胞計數、腫瘤指標、心超肺動脈壓、胸部CT影像學分型、肺功能檢查、動脈血氣分析等，通過電話隨訪記錄患者治療及轉歸(隨訪時間 2020年08月01日)。

三、血清中KL-6、IL-4、SP-D和TGF-β 表達水平檢測

晨取靜脈血，離心收集血清，置于-20℃凍存待檢測。(1)應用化學發光酶免疫分析(CLEIA)法檢測血清KL-6水平，試劑盒來自富士瑞必歐株式會社，按說明書進行操作，通過LUMIPULSE G1200 全自動免疫分析儀進行同批檢測，并設置復孔取均值。(2)檢測血清IL-4、SP-D和TGF-β水平，試劑盒來自CUSABIO公司，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行操作，通過全自動酶標儀(芬蘭，Thermo Lab systems)進行同批檢測，并設置復孔取均值。血清標本均采用患者及健康體檢者剩余血標本，獲得南京鼓樓醫院倫理委員會批準。

四、統計學處理

結 果

一、臨床特征

31例pSS-ILD的患者，其中男9例(29.0%)，女22例(71.0%)，男女比例1：2.4，年齡35～78(60±11)歲，臨床癥狀主要以干咳31例(100%)及胸悶氣喘27例(87.1%)最為常見，僅2例(6.5%)出現反復低熱癥狀，其中1例后續診斷合并肺結核，予正規抗結核治療后好轉，干燥綜合征相關口干、眼干癥狀者分別為17例(54.8%)、13例(41.9%)，典型反復口腔潰瘍者2例(6.5%)相對較少，其他非特異性癥狀如關節痛、雷諾現象分別為6例(19.4%)、1例(3.2%)，所有確診患者肺部聽診均可聞及捻發音，通過心臟超聲進行估測，其中27例(87.1%)患者合并有肺動脈高壓(見表2)。

初診為原發性干燥綜合征的患者，通過后續7年的跟蹤隨訪，有3例(9.7%)患者合并多發性肌炎/皮肌炎，1例(3.22%)患者合并有系統性硬化癥，5例(16.1%)患者合并有類風濕關節炎，4例(12.9%)患者合并有惡性腫瘤，分別為乳腺癌、肺癌，1例(3.22%)患者合并有腎小球腎炎，2例(6.5%)患者合并有結節病，1例(3.22%)患者合并有MALT淋巴瘤，有4例(12.9%)患者病程中曾出現重癥感染，以機會性感染為主。截止最終隨訪日期2020年8月1日，31例患者有8例死亡，其中6例(19.4%)死于肺部原發病，2例(6.45%)死于惡性腫瘤(見表2)。

表2 31例pSS-ILD患者的基線臨床特征及預后

二、影像學特征

本研究31例pSS-ILD患者中，常見影像學表現包括：網格影31例(100%)、支氣管壁增厚27例(87.1%)、胸膜增厚25例(80.6%)、磨玻璃影21例(67.7%)，其它影像學表現有：胸膜下線17例(54.8%)、牽拉性支氣管擴張16例(51.6%)、縱隔淋巴結輕度腫大、薄壁氣囊比例相對較低，均為8例(25.8%)，可見明顯肺動脈增寬者僅6例(19.4%)。因此，網格影和支氣管壁增厚為pSS-ILD患者最常見影像學表現。此外，按照影像學特點進行影像學分型，其中NSIP最為常見，有16例(51.6%)為單純NSIP，而NSIP合并機化性肺炎(OP)或NSIP合并LIP分別為2例(6.5%)、4例(12.9%)，單純OP表現者3例(9.7%)，單純普通間質性肺炎(UIP)者5例(16.1%)，NSIP合并UIP者1例(3.2%)(見表3)。

表3 31例pSS-ILD患者的影像學表現及分型

三、pSS-ILD組與肺炎組、健康對照組血清KL-6、IL-4、SP-D和TGF-β水平比較

采用Kruskal Wallis檢驗，結果表明在pSS-ILD組、肺炎組和健康對照組三組之間可以認為血清KL-6、IL-4和SP-D水平比較均有差異，以上P均<0.01，差異有顯著統計學意義。TGF-β水平在三組之間差異均無統計學意義(P>0.05)(見表4)。

通過組間兩兩比較，pSS-ILD組血清KL-6表達水平中位數為1201(956，1651)U/mL，顯著高于肺炎組(P<0.01)，也顯著高于健康對照組(P<0.01)，差異有顯著統計學意義；而pSS-ILD組血清IL-4表達水平為2.27(1.77，2.73)ng/mL，顯著低于健康對照組(P<0.01)，差異有顯著統計學意義，但與肺炎組比較無統計學意義；而血清SP-D水平比較，pSS-ILD組中位數為9.97(4.64，16.76)ng/mL，顯著高于肺炎組，但與健康對照組比較無統計學意義(見表4)。

表4 pSS-ILD組與肺炎組、健康對照組血清KL-6、IL-4、SP-D和TGF-β水平比

四、血清KL-6水平用于診斷pSS-ILD的ROC曲線分析

血清KL-6水平用于診斷pSS-ILD其ROC曲線見圖1，計算其最佳Cut-off值為>858 U/mL，AUC為 0.973，與0.5相比差異有顯著統計學意義(P<0.001)，95%可信區間為0.941～1.0，約登指數為0.806，敏感度 80.6%，特異度100%(見圖1)。

圖1 血清KL-6水平診斷pSS-ILD的ROC曲線

五、不同KL-6水平患者血清學指標及肺功能參數的比較

因課題組前期研究發現，血清KL-6水平能反應間質性肺疾病的嚴重程度，將pSS-ILD患者分為KL-6水平≥1000 U/mL及<1000 U/mL兩組，比較兩組間血清學標志物及肺功能參數的差異。KL-6水平≥1000 U/mL共有22例，而KL-6水平<1000 U/mL共有9例，通過兩組血清學指標比較發現，前組IL-4水平顯著低于后組，分別為(2.21±0.69)ng/mL、(2.82±0.76)ng/mL，血清球蛋白前組顯著高于后組，分別為(29.73±6.79)g/L、(24.48±3.59)g/L，CRP前組顯著高于后組，16.9(7.3,30.4)mg/L比 5.5(2.6,10.7)mg/L，CD4+淋巴細胞的比值，前組顯著高于后組，(39.7±9.7)%比(31.4±6.3)%，PaCO2前組顯著高于后組，(40.2±3.5)mmHg比(37.4±2.8)mmHg(P均<0.05)，以上差異有統計學意義(見表5)。

通過比較兩組的肺功能參數發現，用力肺活量FVC的值及占預計值的百分比，前組均顯著低于后組，FVC分別為(1.74±0.55)L比(2.32±0.65)L，FVC %分別為(58.5±15.9)%比(74.5±16.2)%(P均<0.05)，差異有統計學意義。而一秒率、彌散量未發現顯著差異(見表5)。

六、存活組與死亡組患者血清學指標及肺功能參數的比較

將pSS-ILD患者分為存活組與死亡組，比較兩組間血清學標志物及肺功能參數的差異。存活組共23例患者，而死亡組共8例患者，血清學標志物方面，KL-6水平兩組并無顯著差異，而IL-4水平存活組顯著低于死亡組，分別為(2.17±0.65)ng/mL比(3.01±0.69)ng/mL，血清LDH水平，存活組顯著低于死亡組，分別為244(219,304)U/L 比325(264，336)U/L，通過心超估算肺動脈壓力，存活組肺動脈壓顯著低于死亡組，分別為(31.8±5.5)mmHg 比(38.8±8.3)mmHg(P均<0.05)，差異有統計學意義(見表5)。

表5 不同水平KL-6組和隨訪結局組的相關實驗室指標

討 論

原發性干燥綜合征(pSS)是一種T細胞介導、B細胞功能亢進所致的多系統受累的自身免疫病，免疫炎癥反應主要累及外分泌腺體的上皮細胞，以中年女性多見。間質性肺病是干燥綜合征最為常見且嚴重的并發癥之一，pSS累及肺臟常提示預后不良，KREIDER M等報道pSS中ILD的發生率為9%～20%，我國16個臨床中心調查研究數據顯示pSS中ILD發生率為28.8%[7-8]。本研究結果顯示，pSS-ILD患者最常見的肺部癥狀為反復干咳、胸悶氣喘，部分患者以肺部為首發癥狀就診，雖然干燥綜合征患者可出現反復低熱，但本例中發熱患者比例較少，且需注意排除感染性疾病方可診斷。僅一半患者出現口干、眼干等干燥綜合征典型癥狀，這與高輝等[9]的回顧性研究結果較為一致。所有患者肺部聽診均可聞及捻發音，因此肺部聽診可作為是否合并間質性肺病早期篩查的有效手段。

pSS-ILD以淋巴細胞浸潤上下呼吸道為其病理表現，導致肺部炎癥反應，肺功能表現為限制性通氣功能障礙和/或彌散功能障礙。既往研究認為，淋巴細胞間質性肺炎LIP是SS-ILD最常見的病理類型，但國內外回顧性研究表明，非特異性間質性肺炎NSIP為最常見病理類型。Ramos-Casals Manuel等[10]的回顧性研究發現，45%的患者為非特異性間質性肺炎，16%為普通型間質性肺炎，15%為淋巴細胞型間質性肺炎，7%為機化性肺炎。本研究pSS-ILD影像學表現中，最常見的為網格影、支氣管壁增厚、胸膜增厚，磨玻璃影也較為常見，但縱隔淋巴結腫大、薄壁氣囊的比例并不高，影像學分型結果表明，NSIP最為常見，占51.6%，與文獻報道較為一致，而特征性的LIP比例偏低，其他常見類型包括UIP、OP。

KL-6主要定位于肺泡II型上皮細胞、支氣管上皮細胞的細胞質和細胞膜，能促進成纖維細胞的增殖和遷徙，抑制細胞凋亡，加重肺纖維化的進展。本課題組的前期研究表明，以KL-6>500U/mL作為診斷間質性肺炎的診斷標準，其敏感性為83.89%，特異性為92.24%，ROC曲線下面積可達到0.931[11]。近期韓國的學者回顧性研究了549名合并有類風濕性關節炎、系統性硬化癥、炎癥性肌病和其他伴或不伴有ILD的CTD患者，通過CT掃描對ILD進行半定量分級，相關性分析結果顯示，一氧化碳彌散量(DLCO)和用力肺活量占預計值的百分比與KL-6水平呈中度負相關，而KL-6水平與CT分級呈正相關，說明KL-6水平可反映CTD-ILD的嚴重程度[12]。本研究中，干燥綜合征繼發間質性肺病組，血清KL-6水平顯著高于肺炎組，也顯著高于健康對照組，且ROC曲線分析提示，最佳Cut-off值為>858 U/mL，曲線下面積AUC為 0.973，敏感性、特異性均較為理想。但仍需進一步擴大樣本量，增加干燥綜合征伴或不伴ILD的兩組進行比較，提高血清KL-6在pSS-ILD中的診斷價值。

SS最主要的特征為外分泌腺的淋巴細胞浸潤，研究表明，SS患者外分泌腺浸潤的淋巴細胞中60%～70%是T淋巴細胞，而其中70%以上為CD4+T細胞，SS患者中以Th1、Th17細胞因子為主導的微環境促使炎癥朝慢性化發展，而以Th2細胞因子為主導的微環境有利于B細胞的激活，并促進了自身抗體的產生[13]。Th2釋放的細胞因子在維持B細胞功能中起重要作用，而高度活化的B細胞可介導pSS出現臨床表現的進展[14]。IL-4是Th2的標志性細胞因子，參與體液免疫，IL-4可促進Th0向Th2細胞分化，同時抑制Th1應答的激活和細胞免疫。本研究血清學檢測結果顯示，pSS-ILD患者血清IL-4水平是顯著低于健康對照組的，但ILD組與肺炎組差異無統計學差異。姜兆榮等[15]研究發現，干燥綜合征模型小鼠頜下腺IL-4蛋白含量顯著高于正常組。因此，在活動期pSS-ILD患者中，是否血清中IL-4水平下降，累及腺體組織中IL-4表達升高，還有待進一步研究。IL-4水平僅能一定程度反應體內Th2細胞的活化及體液免疫的水平，并不能作為pSS-ILD診斷的理想的血清學指標。血清SP-D、TGF-β 被認為與肺間質纖維化的發生、發展密切相關，但本研究中pSS-ILD組與肺炎組及健康對照組并無顯著差異，考慮與干燥綜合征相對進展緩慢、UIP型間質性肺病者比例偏少相關。

Doishita等[16]的研究發現，血清KL-6水平高于500U/L是結締組織病并發ILD的標志，高于1000U/mL是結締組織病并發活動性ILD的標志。因此，本研究將pSS-ILD患者分為KL-6水平≥1000 U/mL及<1000 U/mL兩組，結果發現，在KL-6水平≥1000 U/mL組，血清IL-4水平顯著下降，血清球蛋白、C反應蛋白顯著升高，說明嚴重組炎癥反應更強，體液免疫亢進，活動期患者CD4+淋巴細胞的比值顯著升高，而PaCO2顯著升高，體現了活動期患者有呼吸功能減退、并發呼吸衰竭的風險，用力肺活量FVC的值及占預計值的百分比均顯著下降，說明活動期患者肺功能顯著下降，但DLCO并未發現顯著差異，考慮與樣本量偏少及患者配合度相關。因此，需進一步擴大樣本量以評估KL-6水平與疾病嚴重程度的關系。通過7年隨訪，根據患者預后分為存活組與死亡組，兩組間KL-6水平并無顯著差異，考慮與樣本量少、部分患者是因合并腫瘤死亡而非間質性肺病有關。死亡組患者血清LDH水平顯著高于存活組，肺動脈壓也顯著高于存活組，在間質性肺病出現肺損傷的發生過程中，肺II型肺泡上皮細胞、中性粒細胞等可產生大量LDH并入血，從而引起血清LDH升高，Zou J.等[17]研究發現，LDH是無肌病性皮肌炎合并間質性肺炎預后的重要因素。因此，LDH顯著升高、肺動脈壓升高可能是pSS-ILD患者預后不良的風險因素。

綜上所述，pSS-ILD患者臨床表現無特異性，最常見的肺部癥狀為干咳、胸悶氣喘，肺部捻發音陽性率高，肺部聽診可作為合并ILD的早期有效篩查手段。其影像學特征以NSIP型最為常見，而特征性的LIP比例偏低。本研究證實KL-6可作為pSS-ILD診斷及病情評估的理想血清標志物，而LDH顯著升高、肺動脈高壓可能提示pSS-ILD患者預后不良的風險因素。但是本研究存在一定的局限性，因樣本數量有限，研究結果需要在大樣本中進行驗證。