淋巴吻合培訓動物模型的制備

盧鴻瑞 謝慶平

隨著顯微外科技術的發展，顯微淋巴吻合技術在臨床上被廣泛開展，但大部分顯微外科醫師并沒有熟練的淋巴管解剖和吻合經驗。簡便實用的淋巴吻合動物培訓模型是廣泛開展此類手術的關鍵。因目前缺乏一個理想的淋巴吻合的動物模型，本研究擬制備一種取材方便、淋巴管染色清晰的用于培訓淋巴吻合技術的動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

20 只SPF 雄性白來航雞，2～3 月齡，體質量1 800～2 500 g。實驗前，將實驗動物飼養于空調恒溫室內（24 ℃～25 ℃），保證溫度濕度穩定、環境干凈、通風條件良好，以標準條件常規飼養1 周時間。

亞甲藍注射液2 mL/20 mg（濟川藥業集團有限公司）；100 g/L 硫化鈉；生理鹽水；75%醫用乙醇；聚維酮碘。

手術顯微鏡（ZEISS OPMI Vario S88）；一次性使用剖切刀（北京博?？翟瘁t療器械有限公司）；固定板；持針鉗；顯微剪；手術刀；線剪；尼龍單絲11-0/12-0 線帶縫合針（上海浦東金環醫療用品股份有限公司）；醫用備皮刀（揚州市華威醫療器械有限公司）；數顯游標卡尺（Mitutoto，日本）。

1.2 方法

1.2.1 分組

按培訓要求，受訓人員每組2 人，一人主刀，一人協助，進行交換重復多次的練習，每3 組隨機挑選20 只白來航雞，進行動物模型制備和顯微操作培訓。

1.2.2 實驗動物術前準備和染色處理

抓取健康的實驗動物，進行操作前準備。取亞甲藍注射液（美藍染色劑）2 mL，從動物眼眶上緣注入腦組織內，進行染色處理；染色后結扎動物的頸根部，使得實驗區域的靜脈充盈，經眼眶向顱內注入5～10 mL 空氣處死實驗動物。使用10 mL 硫化鈉對雞的頸部進行干性脫毛處理，脫毛后采用塑料袋和膠帶分別密封包扎雞的頭部及體部，放置試驗臺固定，使用聚維酮碘消毒后備用（圖1）。

圖1 動物的培訓前準備Fig.1 Pre-training preparation of animals

1.2.3 顯微鏡下分離和吻合淋巴

采用11 號手術刀片在動物頸部沿切口線行8 cm 縱行切口，切開皮膚及皮下筋膜組織，采用2-0絲線多點定位牽開皮膚及皮下組織，沿著頸動脈鞘尋找被亞甲藍染色后的淋巴管。在20 倍顯微鏡下解剖分離淋巴管、淋巴結和脂肪內靜脈，并用11-0/12-0 線進行淋巴管靜脈端端吻合、端側吻合和淋巴結靜脈吻合的操作練習（圖2）。

圖2 淋巴管的解剖分離Fig.2 Dissection of lymphatic vessels

1.2.4 淋巴管靜脈吻合設計

淋巴管靜脈吻合術（LVA）是指將淋巴管離斷后的遠心端與管徑相近的靜脈管近心端行端端吻合或與靜脈管行端側吻合的方法。

淋巴管與靜脈的端端吻合：解剖顯露染色的淋巴管及鄰近的口徑相似的靜脈，調整吻合張力后在16 倍顯微鏡下切斷淋巴管和靜脈管，對淋巴管近心端不予處理，靜脈管遠端結扎止血。采用數顯游標卡尺分別測量靜脈和淋巴管的口徑后，在吻合口處修剪淋巴管、靜脈管管口。使用帶針的11-0 或12-0顯微吻合線在6 點鐘處首先定位縫合，對淋巴管管徑0.2 mm 及以下者在2 點鐘處和10 點鐘處再縫合2 針固定，淋巴管管徑0.2 mm 以上者在0 點、3 點、9點鐘處再縫合3 針固定。要求邊距及針距均勻，輕微外翻打結。

淋巴管與靜脈管的端側吻合：適用于解剖顯露的淋巴管和靜脈管管徑相差較大時。在靜脈管朝向淋巴管側采用顯微剖切刀切開靜脈管壁0.3 mm，在6 點鐘處首先定位縫合淋巴管口與血管后壁，根據淋巴管口徑的不同采用不同的縫合法。對淋巴管徑0.2 mm 及以下者采用3 點吻合法，分別在2 點鐘處和10 點鐘處再縫合2 針行端側吻合；淋巴管管徑在0.2 mm 以上時采用4 點吻合法，分別在0 點、3點、9 點鐘處再縫合3 針行端側吻合（圖3）。

圖3 淋巴靜脈吻合術Fig.3 Lymphatic vein anastomosis

1.2.5 淋巴結靜脈吻合設計

在20 倍顯微鏡下解剖分離淋巴結與相鄰的靜脈管，根據靜脈管口徑選擇吻合方式：靜脈管口徑小于0.3 mm 時采用遠端結扎、近端端端吻合的方式進行，淋巴結一側切除1/4～1/3 的淋巴結組織，將修剪后呈魚口狀的靜脈管近心端端口與淋巴結的創面使用帶針的11-0 或12-0 顯微吻合線進行4 針法方式固定，分別于0 點、3 點、6 點、9 點鐘處縫合；當靜脈管徑大于0.3 mm 時，采用顯微剖切刀切開面向淋巴結的靜脈管壁0.3 mm，淋巴結一側切除1/4～1/3的淋巴結組織，將靜脈側壁口與淋巴結創面使用帶針的11-0 或12-0 顯微吻合線進行4 針法方式固定，分別于0 點、3 點、6 點、9 點鐘處縫合。

1.2.6 培訓和觀察情況

吻合完畢，采用血管通暢實驗的方法，觀察吻合口通暢情況，并及時記錄異常情況。吻合口通暢性檢驗：①采用由遠至近淋巴管勒血實驗檢查靜脈血管內的血液是否被推移；②采用由近至遠靜脈管勒血實驗觀察靜脈管內血液是否通過吻合口進入淋巴管。通過多次檢驗判斷淋巴管和靜脈通暢程度，主刀和助手進行對換，反復訓練吻合技術（圖4）。

圖4 觀察吻合口通暢情況Fig.4 Observation of the patency of anastomosis

2 結果

2.1 一般情況觀察

初級培訓要求：①熟練掌握動物處理、亞甲藍注射液染色、處死、備皮等操作，熟悉固定解剖，尋找染色淋巴管及淋巴結、靜脈。②進行淋巴管與靜脈吻合20 次。

高級培訓要求：在初級培訓要求的基礎上，熟練掌握各種管徑和各種方法的淋巴管/淋巴結靜脈吻合，累計吻合次數60 次，吻合口即時通暢率達80%。

2.2 培訓效果評價

顯微外科淋巴管和靜脈吻合學習曲線如圖5 所示，操作時間和通暢吻合口數量呈正相關。

圖5 淋巴管靜脈吻合學習曲線Fig.5 Learning curve of lymphatic vein anastomosis

3 討論

乳腺癌是女性最常見的癌癥[1]，每5 例乳腺癌術后女性中就有1 例會在淋巴結切除術后出現上肢淋巴水腫[2]。肢體淋巴水腫除導致肢體腫脹和功能障礙外，也影響淋巴相關的免疫反應的調節，導致皮膚軟組織炎癥，使得患者感染丹毒的風險升高，嚴重影響生活質量。乳腺癌根治術的一般標準程序是切除腫瘤區域所有的淋巴結，雖然改進后采用前哨淋巴結活檢和選擇性淋巴結清掃術，但乳腺癌根治術后仍有4%～10%的淋巴水腫發生率[3]。下肢淋巴清掃后也很容易導致下肢淋巴水腫，大約20%的患者在腹股溝淋巴結清掃術后發生淋巴水腫[4]。

1962 年，首次提出在淋巴管和靜脈之間建立吻合，將淋巴液提前分流到靜脈系統，可用于治療肢體慢性淋巴水腫[5]。1976 年，O'Brien 等[6]的臨床報告證實了這種方法的臨床有效性，淋巴顯微外科領域有了重大突破。此后，隨著超級顯微外科吻合技術的推廣，0.3～0.8 mm 的血管吻合技術日趨成熟，這也增加了淋巴管靜脈吻合的可靠性。據報道，使用直徑0.5～0.7 mm 的淋巴管和直徑0.7～1.0 mm 的真皮下靜脈進行淋巴管靜脈吻合，術后隨訪結果良好，此方法逐漸被認為是治療慢性淋巴水腫的有效方法[7-8]。但大部分顯微外科醫師并沒有熟練應用熒光示蹤技術和吻合淋巴管和靜脈的經驗，隨著超級顯微外科淋巴靜脈吻合技術的培訓和推廣，臨床淋巴水腫的治療水平將得以推動。

因此，建立簡便實用的淋巴吻合技術培訓動物模型是廣泛開展此類手術的關鍵。文獻報道的第一個穩定的淋巴水腫動物模型是Olszewski 等[9]于1968 年在狗身上建立的。他們通過創新性的周向切除法，對淺部和深部淋巴管進行雙層切割，建立了第一個可靠和可重復的獲得性淋巴水腫模型。之后，Das 等[10]于1981 年在此基礎上結合放射線照射后獲得比較可靠的淋巴水腫模型，基本可以誘發動物肢體淋巴水腫，但其需要有特殊的途徑和較為復雜的制備過程。之后，這種周向切除淋巴管的方法被應用于兔耳[11-12]和嚙齒動物后肢模型[13-14]。也有研究制作了嚙齒動物尾巴模型[15]。

但此類動物模型都未得到廣泛的推廣，目前報道的淋巴顯微吻合技術培訓使用的動物模型都存在以下缺陷：狗的模型與人體最相近，但捕捉和飼養困難，費用高，操作難度大；兔耳組織極薄，層次很多，不容易尋找到淋巴管，術后動物容易感染致死；大白鼠的動物模型雖然容易制作，但以急性淋巴水腫模型為主，難以獲得比較可靠的慢性淋巴水腫模型，且大白鼠血管淋巴管細小，難以進行以培訓為目的的淋巴靜脈吻合。因此，目前仍未有一種可被廣泛應用的淋巴吻合培訓動物模型。

我們根據目前淋巴水腫動物模型制備的優缺點，提出了使用雞的頸部淋巴管靜脈吻合模型的設想，經過實踐，取得了可靠的淋巴管靜脈吻合的培訓效果，受訓人員經過2～4 周的培訓，獲得80%的吻合口通暢率。該培訓結果具備培訓周期短、培訓費用低、培訓場地建設容易等特點；該動物模型的制備具備可靠、穩定、制作簡單的優點。

在本組動物模型制備中，我們采用亞甲藍染色劑通過腦組織內染色的方法在實驗區獲得了清晰的淋巴管顯影，同時實驗區的染色污染較輕，為淋巴靜脈吻合技術培訓創造了有利條件，是目前淋巴管靜脈吻合培訓的可靠動物模型之一。

4 結論

雞是制備淋巴染色及淋巴靜脈吻合培訓的一個比較適合的動物模型。其優點是技術操作可靠穩定，動物獲取成本低，制備過程簡單，可以較好模擬臨床上淋巴管靜脈吻合的場景，是顯微外科醫師超級顯微外科吻合技術培訓的實用模型。