循環腫瘤細胞在局部晚期食管癌放化療中的價值研究

黃于庭，施險峰，汪 超，張 旭，彭萬仁，王 華

食管癌為我國常見的消化道腫瘤，2017年我國新發病例23.5萬例，死亡21.3萬例，位居全球首位[1]。目前對于可切除食管癌仍然以手術為主要治療方式，對于局部晚期食管癌患者，一線治療手段為同步放化療(concurrent radiochemotherapy, CRT)，但效果并不理想[2]。因此，國內外多項臨床試驗正在積極探尋更佳的治療方式，其中，誘導化療+同步放化療(induction chemotherapy & CRT, IC+CRT)為探索方向之一。循環腫瘤細胞(circulating tumor cells, CTCs)是自發或手術污染等原因導致原發或繼發腫瘤進入外周血中的腫瘤細胞，在腫瘤發生、發展及轉移過程中發揮重要作用[3]。血清CTCs陽性一般提示預后不良[4]，部分CTCs可以形成轉移灶，而誘導化療可消滅外周血微轉移灶，降低同步放化療后轉移風險，故CTCs陽性病例選擇IC+CRT模式似乎更為合理，但尚有待考證。該研究旨在通過檢測外周血CTCs，比較局部晚期食管癌患者經IC+CRT與CRT治療后療效、生存期的差異。

1 材料與方法

1.1 入組條件經檢查為局部晚期不可切除的食管鱗癌；一般健康狀態(performance status，PS)評分<2分；治療前均行血清CTCs檢測；無遠處臟器轉移；治療前未行其他抗腫瘤治療；血常規、生化指標基本正常；無嚴重臟器功能障礙。

1.2 病例資料依據入組條件，篩選2016年1月至2019年1月期間，安徽醫科大學附屬巢湖醫院接受同步放化療的食管癌患者臨床資料124例。其中38例患者<65歲， 86例患者≥65歲；男：97例，女：27例； PS評分，0分：43例，1分：81例；依據AJCC第8版食管癌TNM分期標準[5]，III期：45例，IVa期:79例；CTCs(+)：64例，CTCs(-)：60例。根據同步放化療前有無接受誘導化療，分為IC+CRT組62例，CRT組62例；誘導化療方案包括紫杉醇類+鉑類或氟尿嘧啶類+鉑類，同步化療方案包括雙藥三周方案或單藥每周方案。兩組的一般資料特征見表1，差異均無統計學意義。

1.3 CTCs檢測方法初次治療前使用STRECK管采集患者靜脈血9 ml，采用 Next CTC第三代循環腫瘤活細胞自動捕獲儀自動捕獲循環腫瘤細胞。通過免疫熒光原位雜交(FISH)技術鑒定結果：若出現CEP8(+)、DAPI(+)、CD45(-)則判定為CTC，≥2個判定為陽性，<2個判定為陰性。

1.4治療方法① 放療：采用Elekta Precise直線加速器6MV X射線放療，體位選用體部熱塑膜固定，照射技術包括三維適形放療(3-dimensional conformal radiation therapy, 3D-CRT)及靜態野調強放療(intensity modulated radiation therapy, IMRT)，放療范圍為原發食管病灶(gross tumor volume, GTV)、淋巴結轉移瘤(gross tumor volume of lymph node, GTV_nd)、亞臨床病灶(clinical target volume, CTV)共同組成的區域外擴5～10 mm形成的計劃靶區(planning target volume, PTV)。放射劑量依據個體耐受差異為50～66 Gy，分割劑量：1.8～2.0 Gy/f。② 化療：依據患者個體化差異，放療期間采用雙藥三周方案或單藥每周方案同步化療，化療藥物包括：紫杉類、鉑類、氟尿嘧啶類。IC+CRT組患者在放療前接受2～4周期誘導化療，方案為紫杉醇類+鉑類或氟尿嘧啶類+鉑類，治療期間化療藥物劑量均依據不良反應對標準劑量進行調整。

表1 食管癌患者的人口學特征和臨床特征[n(%)]

1.5 療效評價IC+CRT組在誘導化療后2周行化療療效評價，所有患者同步放化療結束3～4周行總體療效評價，評價方法包括食管造影、胸+全腹CT、食管鏡等等，依據實體腫瘤療效評價標準(RECIST)[6]，將治療后的患者療效分為：① 完全緩解(complete remission, CR)：食管造影鋇劑通暢，食管黏膜基本正常；食管鏡未見腫瘤殘存；CT食管管壁最大厚度<1.2 cm；淋巴結直徑<1 cm。② 部分緩解(partial remission, PR)：食管造影鋇劑通過順利，但仍有狹窄，腫瘤處最寬/最窄直徑>1.5；食管鏡殘存腫瘤縮小≥50%；CT可見病灶長徑之和減少≥30%。③ 疾病穩定(stable disease, SD)：食管造影狹窄無變化；食管鏡殘存腫瘤縮小<50%或增大<20%；CT可見病灶長徑之和減少<30%或增大<20%。④ 疾病進展(progressive disease, PD)：食管造影狹窄明顯加重；食管鏡殘存病灶增大≥20%；CT可見病灶長徑之和增大≥20%，或出現新發病灶。

1.6 隨訪療程結束后1個月復查，以后每3個月復查1次(2年以內)，2年以后每6個月復查1次，復查過程中出現病情進展，則每3個月隨訪1次。末次隨訪時間截止于2020年12月，復查項目主要包括：常規體檢、胸腹部CT、腫瘤指標、食管造影、食管鏡，必要時可行血清CTCs、ctDNA、PETCT等。復查時原食管病灶、區域淋巴結較前進展定義為局部復發，出現實質臟器新發轉移瘤或非區域淋巴結轉移瘤定義為遠處轉移。

1.7 統計學處理分類資料采用樣本量(百分比)來描述，組間比較采用χ2檢驗。運用Kaplan-Meier 法計算兩組的總生存期(overall survival, OS)、無進展生存期(progression-free survival, PFS)；采用Cox回歸模型分析影響OS的因素。采用 R 軟件進行森林圖繪制，Graphpad Prism 7.0軟件繪制生存圖，SPSS 23.0 軟件對數據進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CTCs與人口學和臨床特征的關聯124例患者中，CTCs(+)共64例(51.6%)，CTCs(-)60例(48.4%)。CTCs陽性率與腫瘤浸潤(T)(χ2=5.827，P=0.016)、淋巴結轉移(N)(χ2=16.521，P<0.001)、病理分期(χ2=11.888，P=0.001)相關。食管癌治療后遠處轉移率(χ2=4.528，P=0.033)和腫瘤局部復發率(χ2=4.205，P=0.040)均與CTCs指標相關；CTCs(+)患者治療失敗主要原因為遠處轉移(65.6%vs46.7%)，而CTCs(-)患者則為局部復發(66.7%vs48.4%)；CTCs相關因素分析見表2。

表2 CTCs 與人口學和臨床特征的關聯[n(%)]

2.2 CTCs與近期療效IC+CRT組有效人數為45例(CR：18例，PR：27例)，無效人數17例(SD：17例，PD：0例)，客觀緩解率(objective remission rates, ORR)為72.6%；CRT組有效人數為36例(包括CR：16例，PR：20例)，無效人數26例(SD：25例，PD：1例)，ORR為58.1%，兩組間差異無統計學意義(χ2=2.884，P=0.089)。進一步根據CTCs陽性與否進行分層分析顯示，CTCs(+)亞組中，IC+CRT組ORR為72.7%，CRT組為48.4%，差異有統計學意義(χ2=3.978，P=0.046)；在CTCs(-)亞組中，IC+CRT組ORR為72.4%，CRT組為67.7%，差異無統計學意義(χ2=0.156，P=0.693)。見表3。

表3 兩組患者近期療效評價及CTCs分層分析[n(%)]

2.3 CTCs與遠期療效在對124例患者進行隨訪的過程中，共有8例發生失訪。IC+CRT組和CRT組中位OS分別為23個月和15個月，IC+CRT組高于CRT組(χ2=5.286，P=0.021，圖1A)；且IC+CRT組PFS也高于CRT組(IC+CRT：18個月，CRT組：11個月，χ2=4.168；P=0.041，圖1B)。根據CTCs陽性與否進行分層后，CTCs(+)亞組中，IC+CRT組OS高于CRT組(χ2=7.045，P=0.008，圖1C)，中位OS分別為 21個月、12個月；CTCs(-)亞組中兩組中位OS均為24個月，差異無統計學意義(χ2=1.140，P=0.286，圖1D)。

2.4 預后分析Cox回歸單因素分析結果顯示區域淋巴結(Node，N)(HR=1.515，P=0.034)，分期(HR=1.846，P=0.002)和CTCs指標(HR=1.664，P=0.009)是影響OS的危險因素，而放化療模式(HR=0.663，P=0.032)是OS的保護因素。進一步多因素分析結果顯示N差異無統計學意義(HR=0.886，P=0.636)，腫瘤分期(HR=1.844，P=0.019)和CTCs(HR=1.666，P=0.012)指標是影響OS的危險因素，而放化療模式(HR=0.617，P=0.014)是OS的保護因素，即腫瘤分期晚、CTCs陽性的患者OS更短，接受IC+CRT治療的患者比CRT治療的患者OS更長。見表 4。

2.5 遠期療效亞組分析IC+CRT組優于同步組(HR=0.663，P=0.032)。進一步亞組分析顯示年齡≥65歲(HR=0.547，P=0.011)，腫瘤直徑<5 cm(HR=0.563，P=0.017)，病理分級G1～G2(HR=0.563，P=0.017)和CTCs(+)(HR=0.499，P=0.012)亞組中均可獲益，而在其他亞組中差異無統計學意義。見圖2。

圖1 CTCs與OS 和PFS 生存曲線

表4 影響食管癌患者OS的Cox回歸分析

3 討論

2019年NCCN指南將同步放化療作為局部晚期食管癌治療I級推薦[7]，但效果并不理想，對于誘導化療+同步放化療，目前研究結論尚有爭議，本研究通過回顧比較了兩種放化療模式的療效差別，并引入CTCs指標觀察其對不同放化療模式的影響，以期為局部晚期食管鱗癌的放化療模式選擇提供參考。

圖2 兩組間影響OS的亞組分析

CTCs從被提出到進入臨床應用已經經歷了上百年時間，本研究顯示CTCs指標與T、N、分期均有關，并可影響治療后的復發轉移率。Qiao et al[8]對59例食管癌手術患者術前CTCs樣本分析發現：CTCs與腫瘤分化程度、腫瘤浸潤、淋巴結和遠處轉移均有關，cox回歸分析發現：性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤分化和腫瘤大小均與OS和PFS無關。相反，術前CTCs水平(≥3個CTCs/7.5 ml)、淋巴結轉移、遠處轉移和病理分期與OS和PFS相關，結論與本研究結果相似。CTCs被證實可用于腫瘤的療效及預后判斷，甚至可用于腫瘤治療方案的決策。Zhao et al[9]在115例食管癌手術患者的研究中，57例接受術前化療，58例接受術后化療，兩組的2年OS率及PFS差異無統計學意義。但亞組分析顯示在CTCs(+)的病例中，術前化療組PFS明顯優于術后化療組(71.90%vs38.73%，P=0.037 9)，故建議術前檢測CTCs(+)的患者可優先考慮術前化療。那么，同步放化療與手術同樣作為局部治療，CTCs能否對放療前誘導化療的選擇產生影響值得期待。

目前國內外有關誘導化療+同步放化療用于局部晚期食管癌的前瞻性研究較少，且其價值尚無定論。王修身 等[10]對267例接受同步放化療的食管癌患者根據是否行誘導化療1:1配對分成誘導組及同步組，各85例，結果顯示誘導組ORR(74.1%vs58.8%，P=0.035)、3年PFS率(34.8%vs15.4%，P=0.015)、3年OS率(44.2%vs29.7%，P=0.028)均優于同步組。另一項回顧性研究[11]報道了535例接受新輔助放化療的食管癌患者，其中218例在新輔助放化療前接受了誘導化療，結果顯示誘導組與非誘導組的無病生存率(53.7%vs45.1%，P=0.196)、OS率(55.5%vs54.0%，P=0.792)差異無統計學意義，但亞組分析發現：具有多個高危因素的亞組中，加入誘導化療的患者5年無病生存率提高(40.4%vs26.8%，P=0.03)，5年OS率提高，但差異無統計學意義 (38.0%vs28.5%，P=0.238)，從而認為誘導化療針對預后不良的患者獲益更大。本研究顯示，兩組近期療效接近有統計學意義(P=0.089)，遠期療效誘導組優于同步組，PFS、2年OS率、3年OS率均優于同步組。提示誘導化療可提高患者生存，但進一步研究發現，并非所有患者均可從誘導化療中獲益。Kuvendjiska et al[12]對20例食管癌患者新輔助化療、手術前后全程CTCs監測的研究中認為：CTCs指標可以在制定治療方案前提供重要信息，如果術前血清中檢測到CTCs，則術前新輔助治療可能為更佳選擇。在本研究中，CTCs(+)患者在加入誘導化療后近期療效、遠期療效均明顯提高，而CTC(-)患者則獲益不明顯，提示針對CTCs(+)病例選擇誘導化療更為適合，同時推斷CTCs(-)可能為部分研究中誘導化療無法提高生存獲益的原因之一。另外，對遠期療效亞組分析時發現，病理分級G3～G4、年齡<65歲、腫瘤直徑>5 cm誘導化療獲益不明顯，可能與低分化癌迅速進展、進展后續治療方案選擇、誘導化療方案無效[13]、化療藥物劑量等因素有關，需要進一步展開前瞻性研究探索。

本研究有一定局限性，回顧研究受限于病例數選擇，及個體體質差異，少部分高齡、耐受性較差患者需要針對性個體化治療，無法統一化療藥物劑量，可能會對研究結果產生些許影響。

綜上所述，同步放化療前加入誘導化療可提高局部晚期食管癌患者的療效及生存率，其中，CTCs(+)患者兩種放化療模式生存差異更加明顯，而CTCs(-)患者差異則無統計學意義，提示CTCs指標對放化療模式的選擇可能具有一定參考價值，值得展開前瞻性大樣本量研究進一步證實。