滑膜肉瘤中P300與EMT相關蛋白的表達及臨床意義

陳 浩，張 貞，王 寧，董雙雙，連小娟，梁偉華，蔣金芳，龐麗娟，齊 妍

滑膜肉瘤(synovial sarcoma, SS)是一種較少見的具有雙相分化、高侵襲性的軟組織腫瘤，約占軟組織肉瘤的10%；特征是存在特異性t (X;18)(p11;q11)易位產生SYT(18q11.2)-SSX(Xp11.2)融合基因，是SS主要致瘤因素且在臨床病理診斷中發揮重要作用。SS的組織形態學主要有BSS和MFSS兩種類型，前者在梭形細胞背景下表現為腺體或巣團上皮樣細胞，后者以梭形細胞為主[1]。課題組前期研究[2-3]表明，上皮間葉轉化(epithelial mesenchymal transition, EMT)相關因子在SS的上皮和間葉成分中表達水平存在的差異，提示SS與EMT密切相關；通過外顯子芯片方法在SS中的上皮和間葉成分篩選出差異基因23個，包括轉化生長因子-β(transforming growth factor,TGF-β)通路下游基因P300。該文通過檢測SS不同組織成分中P300及EMT相關蛋白的表達，探討P300在滑膜肉瘤EMT中的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 病例材料收集自1968-2015年石河子大學醫學院第一附屬醫院病理科和新疆醫科大學第一附屬醫院病理科SS石蠟包埋組織40例，根據WHO軟組織最新分類標準(第五版)和Enzinger&Weiss軟組織腫瘤進行分型和分類，病理組織學分級參照法國癌癥中心聯盟軟組織肉瘤分級系統；TNM分期參照國際抗癌協會與美國癌癥聯合委員會制定的TNM分期系統。所有病例均進行免疫組化及一步法RT-PCR技術檢測SYT-SSX融合基因檢測進行最終確診，其中包括雙相型30例，單相纖維型10例。所有樣本由資深病理醫師復診。40例SS患者中隨訪例數為25例，因聯系方式或住址更換等原因導致15例失訪，隨訪率為62.5%。

1.2 融合基因檢測提取樣本組織中的RNA(石蠟TRIzol法，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司)，用一步法RT-PCR(試劑盒來自QIAGEN公司)擴增融合基因SYT-SSXl和SYT-SSX2(引物由Sangon合成，引物序列及退火溫度見表1)，經1.5%瓊脂糖(BBI)凝膠電泳分析結果。

表1 PCR所用引物序列、引物對、退火溫度及擴增片段大小

1.3 免疫組織化學及結果判讀實驗采用Envision二步法試劑盒(北京中杉公司)，設立空白、陽性及陰性對照。檢測P300(1 ∶500，英國Abcam公司)及31例SS中E-cadherin(1 ∶200， 丹麥DAKO公司)，N-cadherin、β-catenin(1 ∶400)、Snail(1 ∶800)、Slug(1 ∶200)(英國Abcam公司)蛋白表達情況。判定染色結果采用統一評分標準，由兩位高年資病理醫師獨立雙盲閱片，結果取平均值。根據陽性細胞百分比和著色強度評分，結合陽性細胞及著色強度相乘分級，積分0～1分為陰性(-)，2～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性()，9～12分為強陽性()。

1.4 統計學處理應用SPSS 26.0分析軟件，采用卡方檢驗或Fisher確切概率法對實驗所得P300、SYT-SSX表達情況數據進行統計分析，分析P300與滑膜肉瘤臨床與病理資料之間的關系以及P300與E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug的相關性。運用 Cox 回歸模型對 SS 患者總生存時間進行多因素分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 P300表達與SS臨床病理信息的相關性在40例SS中P300表達率為95%(38/40)。結果表明P300的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、發生部位、融合基因分型、組織學分級、TNM分期以及有無遠處轉移均無統計學意義(表2)。

表2 P300與滑膜肉瘤臨床病理參數的關系

對所有患者進行隨訪，僅獲得25例患者隨訪資料，隨訪時間約為3～69個月，中位隨訪時間為26個月，其中10例存活，15例死亡。通過 Cox 回歸模型探討SS患者臨床病理參數對患者總生存時間的影響顯示，腫瘤發生轉移(P=0.019)和TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(P=0.003)是患者總生存時間的獨立危險因素(表3)，而患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、融合基因分型以及組織學分級與患者生存時間沒有明顯相關性。

表3 SS患者生存時間多因素Cox回歸分析

2.2 SYT-SSX融合基因與組織學分型的相關性40例SS患者中SYT-SSX融合基因陽性率為92.5%(37/40)，其中BSS和MFSS分別為90%(27/30)、100%(10/10)。用一步法RT-PCR分別檢測SYT-SSXl型和SYT-SSX2型，擴增產物為118 bp (圖1)。30例BSS中，SYT-SSX1型的陽性率為66.7%(18/27)，SYT-SSX2型為33.3%(9/27)；10例MFSS中，SYT-SSX1型為80%(8/10)，SYT-SSX2型為20%(2/10)。融合基因類型與SS組織學類型間的差異無統計學意義(P=0.688)，可能與樣本數量較少有關。

圖1 滑膜肉瘤SYT-SSX融合基因RT-PCR擴增產物(118bp)電泳圖

2.3 P300在BSS及MFSS中的表達P300在腫瘤細胞呈胞核著色。BSS中P300表達率為93.3%(28/30)，強陽性率為33.3%(10/30)，在上皮樣區表達明顯高于梭形細胞區(圖2A)。MFSS中P300表達率為100%(10/10)，強陽性率為60.0%(6/10)(圖2B)。P300在MFSS中的表達陽性強度高于BSS，兩者差異無統計學意義(P<0.05)。

圖2 P300在滑膜肉瘤不同組織學亞型中的表達

2.4 P300與EMT相關蛋白在SS中表達的相關性

2.4.1P300與EMT相關蛋白在SS不同組織學類型中的表達 分析P300陽性表達與EMT相關分子表達的相關性(圖3、表4)。在BSS中，P300的表達與EMT相關分子E-cadherin、N-cadherin、Snail和Slug的表達差異無統計學意義，與β-catenin的表達差異有統計學意義(P=0.027)，P300高表達的病例中，77.8%(7/9)β-catenin不表達，反之，P300低表達的病例中，76.9%(10/13)β-catenin陽性表達。

表4 SS中P300與EMT相關蛋白表達的關系[n(%)]

在MFSS中，P300的表達與E-cadherin、N-cadherin、β-catenin和Snail的表達差異無統計學意義，而與Slug的表達差異有統計學意義(P=0.048)，P300高表達的病例中，80%(4/5)Slug不表達，P300低表達的病例中，100%(4/4)Slug呈陽性表達。以上結果提示P300可能在SS的EMT過程中發揮一定作用。

圖3 EMT相關蛋白在BSS和MFSS中的表達 EnVision ×200

2.4.2P300與EMT相關蛋白在BSS不同細胞成分中的表達 分析BSS的上皮樣細胞成分和梭形細胞成分中P300與EMT的關系(表5)。在BSS上皮樣細胞成分中，P300的高表達率為63.3%，其中E-cadherin、N-cadherin和β-catenin高表達，Snail和Slug低表達；而P300低表達的病例中E-cadherin、N-cadherin、β-catenin、Slug和Snail均高表達，差異無統計學意義。在梭形細胞成分中，P300的高表達率為26.7%(8/30)。無論在P300高表達還是低表達的病例中，P300與EMT相關蛋白的表達差異均無統計學意義。

3 討論

幾乎所有的SS都具有特征性融合基因SYT-SSX，其不僅可以作為臨床病理診斷有效的檢測指標，而且在致瘤過程中具有重要作用[4]。SS的發生發展可能與EMT相關，且融合基因有一定的調控作用。Ladanyi et al[5]對243例SS病例分析發現，98%的患者表達SYT-SSX基因，其中61%為SYT-SSX1，37%為SYT-SSX2；BSS中SYT-SSX1的表達高于SYT-SSX2，MFSS中SYT-SSX1的表達低于SYT-SSX2，認為SYT-SSX1基因可能更容易促進腫瘤細胞上皮分化。Wei et al[6]對37例SS研究發現，SYT-SSX的表達率為89.2%，BSS均為SYT-SSX1型，MFSS均為SYT-SSX2型；表明SYT-SSX與SS的組織學分型可能有關。本研究中66.7%的BSS存在SYT-SSX1，33.3%為SYT-SSX2 ，1型明顯高于2型，與文獻報道相符合；但在MFSS中80.0%為SYT-SSX1，20.0%為SYT-SSX2，和文獻報道略有差異，可能與樣本量少有關。

表5 BSS不同細胞成分中P300與EMT相關蛋白的相關性[n(%)]

SYT-SSX可通過干擾Snail、Slug對E-cadherin的轉錄抑制作用，進而影響EMT過程[1]。EMT與間葉性腫瘤和肉瘤的生物學和臨床過程相關，該過程中上皮細胞溶解細胞間連接，獲得具有增強遷移能力的間充質特性，促進了腫瘤細胞的浸潤和轉移。EMT過程受轉錄因子、信號通路和miRNA等很多因素的影響，相關的信號通路有TGF-β、Wnt/β-catenin、PI3K/AKT、Src、Ras-MAPK等。TGF-β作為EMT發展中的一個重要的通路，在腫瘤的發展中發揮重要的促癌作用[7-8]。課題組前期通過分析BSS上皮和間葉兩種細胞成分基因組SNP的改變，顯示兩種成分之間存在23個顯著差異基因(包括P300)，而P300是TGF-β通路中的一個下游基因[3, 9]。P300在TGF-β信號通路中起到關鍵作用，它作為Smad3的轉錄輔活化因子，通過與Smad3的相互作用或介導組蛋白乙酰化促進了TGF-β通路的激活[10]。

P300是轉錄共激活因子組蛋白乙酰轉移家族中的一員,參與多種細胞過程如增殖，分化，凋亡，細胞周期調控和DNA損傷應答的調節[11]。de Bruijn et al[12]研究發現，SS相關蛋白SS18(也稱SYT或SSXT)作為轉錄共激活因子，其活性可能是由P300等因子介導的。Krubasik et al[13]研究發現，在結腸癌中P300的缺乏導致癌細胞的黏附性降低和遷徙能力增加，暗示P300的缺乏可能促進EMT過程。在乳腺癌中的研究中[14]，P300的高表達與病理組織分型、臨床分期和復發轉移呈正相關，縮短了患者的生存期及無疾病進展生存期，提示P300的表達是預測和評估乳腺癌預后的重要獨立因素。P300在肉瘤方面的研究甚少，主要涉及P300作為肉瘤癌蛋白的轉錄輔活化因子[12]，但關于滑膜肉瘤臨床預后及EMT方面的研究甚少。本研究表明，BSS中P300的表達與E-cadherin、N-cadherin、Snail、Slug的表達均無關，但其表達強度與β-catenin密切相關；而在MFSS中P300的表達強度與Slug密切相關。在腫瘤中，Smad依賴性TGF-β通路能夠誘導Snail、Slug等因子的表達，Wnt/β-catenin通路會使細胞質和細胞核中的β-catenin過度表達，從而導致EMT的發生以及腫瘤的轉移[8]，以上提示P300可能參與SS的上皮樣細胞分化以及EMT過程，具體機制尚待進一步深入研究。

綜上所述，P300作為TGF-β信號通路的下游基因可能參與SS上皮分化及EMT過程，在其發生發展中發揮重要作用，從而影響SS的侵襲轉移。