子宮腺肌病在位/異位內膜TRPV 1、OTR的表達與痛經的相關性研究

陳 果，朱雨婷 , 姚 慧，張煒煜，周曙光，蔣曉敏

子宮腺肌病(adenomyosis，AM)是一種常見的內膜浸潤性疾病[1]。其發病機制復雜，痛經是其典型臨床癥狀之一。隨著患者對于生活質量要求的逐步提高，AM在治療及管理過程遇到較大的困難[2]。瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potentialvanilloid type1，TRPV 1)是瞬態電壓感受器 (transient receptor potential，TRP) 陽離子通道家族中被研究最多的成員之一[3]，現有的研究[4]為TRPV1介導痛覺感受器產生動作電位、參與疼痛的調節機制以及痛覺敏化奠定了基礎。Ma et al[5]研究顯示TRPV 1在前列腺素相關炎性疼痛的產生起重要作用。Brenner et al[6]研究表明，催產素(oxytocin, OT)直接作用于子宮內膜上的OT受體(oxytocin receptor, OTR)，進而誘導內膜合成前列腺素(prostaglandin, PGs)。OTR已被證明在子宮內膜異位癥的平滑肌和上皮細胞中過表達，表明它可能參與子宮內膜異位癥的發生[7]。該實驗通過檢測AM在位/異位內膜中TRPV 1和OTR的定位和表達情況，探討TRPV 1和OTR是否在AM痛經機制中發揮相互作用，以期為AM痛經的治療尋找新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1病例資料 本研究實驗組選取2019年1月-2020年12月在婦科就診的60例行子宮切除術或子宮腺肌瘤行腺肌瘤病灶挖除術的子宮腺肌病患者進行回顧性研究。術前經陰道超聲或MRI診斷，術后經病理組織學證實。子宮切除及腺肌瘤病灶挖除術后收集所有患者的子宮內膜組織樣本，連同其同源異位的子宮內膜組織樣本，無菌條件下剪取一部分組織放于液氮中快速凍存用于提取蛋白，另選取一部分組織樣本經10%的福爾馬林固定后用于免疫組化。對照組取手術診斷子宮平滑肌瘤通過刮宮術或子宮切除術時獲取的子宮內膜組織樣本30例，對照組患者均無子宮內膜異位癥相關痛經及其他癥狀。

實驗組和對照組的所有患者均為絕經前女性(排除患有生殖道感染、內分泌、免疫及代謝性疾病的女性)，月經周期正常(21～35 d)，其中實驗組依據術前檢查、術中所見及術后病理排除盆腔及卵巢子宮內膜異位囊腫，對照組排除原發性痛經史患者。在手術或組織收集前6個月未使用激素治療或放置宮內節育器。所有子宮內膜標本均為增殖期。

兩組臨床資料分析包括：患者年齡、孕產次、痛經嚴重程度、經期持續時間、月經量。月經量采用月經失血圖法(PBAC)依據衛生巾浸濕程度分為三度[8]。輕度：浸濕面積超過3/5的衛生巾最多2張；中度：浸濕面積超過3/5的衛生巾3～4張；重度：浸濕面積超過3/5的衛生巾至少5張。其中浸濕面積小于3/5的衛生巾張數換算成浸濕面積超過3/5的衛生巾張數。痛經的嚴重程度依據視覺模擬評分法(VAS)分為四級：0 分為無痛；1～4分為輕度(疼痛但不干擾日常生活或工作，不需要鎮痛藥)，5～7分為中度(疼痛在一定程度上干擾日常生活或工作，服用鎮痛藥后可減輕疼痛)，8～10分為重度(疼痛嚴重干擾日常生活或工作，服用鎮痛藥后不減輕疼痛)。所有標本取材均取得患者知情同意，并通過本院機構倫理審查委員會批準(倫理編號：YYLL2019-2019xkj173-01-01)。

1.1.2主要試劑 TRPV 1兔多克隆抗體(ab3487)(美國Abcam公司)、OTR兔多克隆抗( 230045-1-ap) (武漢三鷹生物公司); HRP標記山羊抗兔二抗、ECL發光試劑盒、RIPA裂解液、GAPDH、免疫組化試劑盒、TRPV 1、OTR引物序列(武漢賽維爾生物科技有限公司)、PVDF膜(上海Millipore公司)。

1.1.3主要儀器 高速冷凍型微量離心機(上海力新儀器公司)、正置光學顯微鏡及成像系統(日本Nikon公司)、Rayto酶標檢測儀(濟南星輝生物儀器公司)、生物安全柜、電泳儀(北京六一儀器廠)、多功能PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 收集異位內膜(ectopic endometrium，EC)，同源在位內膜(eutopic endometrium，EU)以及對照組子宮內膜組織(control endometrium，CE)制成石蠟切片經脫蠟、抗原修復、封閉后加入一抗：OTR抗體和TRPV 1多克隆抗體，4℃孵育過夜，加HRP標記山羊抗兔二抗室溫孵育50 min，滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，蘇木精復染細胞核后脫水封片。用使用Image Pro-Plus 6.0數字圖像對各組織樣本中OTR 、TRPV 1染色進行分析，分別計算陽性細胞百分率及H-score評分，比較各組間免疫反應性差異。

1.2.2Western blot檢測蛋白的表達 分別定量檢測EC、EU、CE組內膜組織中蛋白表達水平，組織剪碎后加入RIPA裂解液，充分裂解后加入PMSF至最終濃度為1 mmol/L配制成組織勻漿液，BCA法測蛋白濃度，按10 μl /孔的量加樣、電泳、轉膜。轉膜后，稀釋一抗，OTR及TRPV 1抗體分別參考抗體說明書進行操作，將二抗用TBST稀釋，洗膜，最后用ECL顯影、定影試劑進行顯影和定影，以GAPDH為內參，Alpha軟件處理系統分析目標帶的吸光度值，分析各指標的相對表達量。

2 結果

2.1 臨床資料觀察實驗組和對照組年齡、孕產次、經期長度、痛經嚴重程度、及月經量等臨床特征。兩組在年齡、孕次、產次、經期長度以及經量方面差異無統計學意義，在痛經程度上差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般臨床資料比較

2.2 CE、EU、EC組內膜組織TRPV 1、OTR免疫組化表達EU、EC組與CE組內膜組織一樣，TRPV 1和OTR染色多數在細胞質中可見，上皮染色比間質染色更強，其中EC組子宮腺肌病灶的肌層和血管內皮細胞中染色可見，免疫組化結果顯示TRPV 1、OTR在EC組表達水平均高于EU、CE組，差異有統計學意義(P<0.05)，而EU組與CE組之間差異無統計學意義。見圖1、圖2、表2 。

2.3 CE、EU、和EC組TRPV 1、OTR的Western blot分析將實驗組按不同痛經程度分組與對照組的TRPV 1、OTR蛋白進行定量分析，見圖3。結果顯示TRPV 1在EC組表達水平高于EU、CE組，差異有統計學意義(P<0.05)，而EU組與CE組之間差異無統計學意義。OTR在EC組表達水平高于EU、CE組，差異有統計學意義(P<0.05)，而EU組與CE組之間差異無統計學意義。見圖4、表3。將EC組按照不同痛經程度(輕度、中度、重度)分組分析顯示，重度痛經組的TRPV 1蛋白表達水平高于輕度痛經組和中度痛經組，差異有統計學意義(P<0.05)，而輕度與中度痛經組之間差異無統計學意義。重度痛經組OTR蛋白表達水平高于輕度痛經組和中度痛經組，差異有統計學意義(P<0.05)，而輕度與中度痛經組之間差異無統計學意義。見圖5、表4。

圖1 TRPV 1和OTR在CE、EU、EC組內膜組織中的免疫組化表達情況 ×200

圖2 TRPV 1和OTR在CE、EU、EC組內膜組織中的免疫組化水平(H-score)

表2 CE、EU、EC組TRPV 1和OTR的在免疫組化中表達水平

圖3 Western blot檢測TRPV 1、OTR蛋白表達情況

表3 CE、EU、EC組TRPV 1和OTR的蛋白表達水平

表4 EC組不同痛經程度TRPV 1和OTR的表達水平

圖4 CE、EU和EC組內膜組織TRPV 1、OTR的蛋白表達情況

圖5 EC組不同痛經程度TRPV 1、OTR蛋白的相對表達

2.4 EC組內膜組織中TRPV 1和OTR表達的相關性分析進一步進行相關性分析顯示EC組內膜組織中TRPV 1、OTR的表達均與痛經程度呈正相關(rs=0.280，P=0.030；rs=0.318，P=0.013)，TRPV 1與OTR的表達呈正相關(rs=0.287，P=0.026)。

3 討論

流行病學研究表明AM流行率較高，且呈年輕化趨勢[9]，部分研究統計，AM的痛經率高達64.8%～77.8%[10]。某些重度痛經患者子宮切除仍作為其最終選擇[11-12]。面對趨于年輕化的患者臨床醫師亟待新的治療方法出現。

目前研究認為，AM引起的繼發性痛經與子宮平滑肌、血管的痙攣性收縮有關。Brenner et al[6]研究顯示，PGs和OT均可使子宮的平滑肌、血管發生不規則收縮，OT作用于子宮內膜上的OTR，結合后啟動磷酸肌醇-蛋白激酶C-花生四烯酸途徑，誘導內膜合成PGs，隨后迅速轉移至胞外以旁分泌的形式與受體結合后刺激子宮平滑肌及血管收縮，造成子宮乏氧微環境導致多種致痛因子產生，大量致痛因子可促進外周神經敏化、神經纖維分布異常增加，引起痛經。本研究發現在異位子宮內膜上皮細胞和間質細胞中，以及異位內膜侵襲病灶的肌層和血管內皮細胞中，OTR表達均增加。并且數據分析顯示OTR在異位內膜的表達水平與痛經的嚴重程度呈正相關。

已有許多研究指出，外周神經敏化是導致內臟疼痛致敏的重要環節，導致外周神經興奮閾值降低的分子可能在神經敏化中起到重要作用，Nie et al[13]通過免疫組化檢測發現TRPV 1在AM異位內膜組織的表達水平顯著升高。TRPV 1受炎癥敏化后其激活閾值顯著降低，產生痛覺過敏和疼痛超敏反應。TRPV 1在動物模型中已被證明在周圍終末或初級感覺神經元上整合多種刺激，如熱(43 ℃), 酸(pH>5.9)和炎性介質，TRPV 1的激活也會導致感覺肽的局部釋放，從而激活器效應細胞受體，促進神經性炎癥的發生。在前列腺素存在下，TRPV 1 激活的溫度閾值降低到 35℃以下，使得TRPV 1 在正常體溫下可以被激活，誘導自發性疼痛[5]。本次實驗通過Western blot檢測顯示TRPV 1在AM的異位內膜組織過高表達，且與痛經程度呈正相關，因此TRPV 1可能是重要治療靶點。

研究者推測痛經的發生機制：①可能與子宮收縮障礙有關，子宮結合帶的收縮依賴于OT[14]，由OTR介導的OT促進子宮內膜細胞釋放PGs。PGs的大量釋放使得TRPV 1在正常體溫下即被激活，誘發疼痛；②史精華 等[15]發現子宮內膜異位病灶中的神經纖維密度增加。TRPV 1作為傳入神經纖維上表達的重要離子通道，通過和炎性介質的相互作用，從多個方面參與了盆腔痛的發生。TRPV 1通過蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)介導，形成一條PKA/C-PGs-TRPV 1的疼痛信號通路。TRPV 1被敏化之后，反過來又會刺激外周傷害性感受器，轉變成神經沖動信號傳遞至中樞神經系統，痛覺程度再次加劇，由此形成疼痛的級聯放大效應[16]。本次研究通過免疫組化及Western blot檢測發現，異位內膜組織的TRPV 1、OTR均高于對照組，且隨著痛經程度的加重其表達量亦呈正相關。因此研究者推測OTR及TRPV 1協同參與了子宮腺肌病痛經的機制。

子宮腺肌病的繼發痛經嚴重影響女性身心健康，一直是臨床研究的熱點問題，本次研究結果顯示OTR及TRPV 1表達在異位內膜組織中顯著升高，且與痛經程度呈正相關。OTR及TRPV 1的拮抗劑可能是未來研究治療子宮腺肌癥患者痛經和慢性盆腔疼痛的潛在靶點。但本課題研究結果僅局限于組織水平，今后可以通過體外實驗建立細胞或動物模型探索TRPV 1配體受體識別過程、信號通路調控機制以及下游趨化因子表達情況等，以便更深入的探討子宮腺肌病痛經的發生機制，為探究子宮腺肌病的治療策略提供新的思路。