基于網絡藥理學方法初探葛花解酒滌脂湯抗酒精性脂肪肝作用

吳雪莉，馮 曉，郝 杰，易 旭

酗酒是世界范圍內肝臟疾病的主要原因之一。大量乙醇攝入會加速肝臟脂肪生成、促進脂肪酸從血液進入肝臟，使脂蛋白滯留肝臟，肝細胞線粒體對脂肪酸的氧化功能減退、肝臟對脂肪消耗減少等不良作用，進而引起肝臟細胞損傷，導致酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease，AFLD)。

課題組經過長期臨床積累，根據AFLD辯證論治、遣方用藥的經驗加以歸納總結，自擬出由葛花、葛根、白茯苓、綿茵陳、小青皮、甘草、決明子、山楂和明礬組成的葛花解酒滌脂湯，前期動物實驗[1-2]已表明該方對酒精性脂肪肝有明顯的治療作用。但由于中藥成分的多樣性和作用機制多靶點、多環節等特點，葛花解酒滌脂湯治療AFLD的主要作用機制仍不明確。與中醫整體觀念一致的網絡藥理學能系統地、整體地揭示疾病-疾病、疾病-靶點蛋白、靶點蛋白-藥物、藥物-藥物之間的聯系。近年來，網絡藥理學已被逐漸應用中醫藥研究中，對進一步發現藥效物質、探索分子作用機制和闡釋其科學內涵具有重要的價值[3]。該研究運用網絡藥理學的方法初探葛花解酒滌脂湯治療酒精性脂肪肝的潛在活性化合物及其可能的作用靶點，以期為葛花解酒滌脂湯后續的深入研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 中藥-化合物數據集的建立自中國傳統醫學百科全書(the encyclopedia of traditional chinese medicine，ETCM，http://www.nrc.ac.cn:9090/ETCM/)和SymMap(https://www.symmap.org)數據庫對葛花解酒滌脂湯中所含9味中藥進行化合物篩選。化合物的篩選條件為：ETCM數據庫中“Druglinkness Grading”為“Moderate”或“Good”；SymMap數據庫中口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%。選取符合條件的化合物作為候選化合物，建立中藥-化合物數據集。

1.2 化合物-靶點數據集的建立根據1.1中篩選得到的候選化合物的CAS號或PubChem ID，于PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找化合物對應的“Canonical SMILES”結構。將化合物的該結構輸入Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch)，限定物種為人(Homo sapiens)，依據成分的“Canonical SMILES”結構進行靶點預測，選取“Probability”大于0的靶點作為化合物對應的靶點，建立葛花解酒滌脂湯化合物-靶點數據集。

1.3 疾病數據集建立以“alcoholic fatty liver”為檢索詞，于GeneCards數據庫(https://www.genecards.org)獲取AFLD相關靶點，建立AFLD靶點數據集。

1.4 藥物-靶點-疾病數據集建立通過Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，將1.2中化合物-靶點數據集與1.3中AFLD靶點數據集進行映射，得到葛花解酒滌脂湯治療AFLD的作用靶點。

1.5 葛花解酒滌脂湯-靶點-AFLD的PPI網絡構建與分析將映射后獲得的葛花解酒滌脂湯治療AFLD作用靶點經STRING數據庫(https://string-db.org)分析獲得蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡，設置最低相互作用閾值為“High confidence(0.900)”，其它參數均保持默認設置。隨后將結果導入Cytoscape(3.6.0)軟件構建葛花解酒滌脂湯靶點-AFLD的PPI網絡。運用Cytoscape軟件中Network Analyzer分析葛花解酒滌脂湯-靶點-AFLD PPI網絡的自由度，根據自由度篩選核心靶點，將自由度>50的靶點納入篩選范圍。

1.6 核心靶點生物功能和通路富集分析運用Cytoscape(3.6.0)軟件中的ClueGo插件對篩選得到的葛花解酒滌脂湯治療AFLD核心靶點進行GO功能富集，以了解方藥可能的功能涉及。再結合KEGG通路富集分析，擬獲得方藥治療AFLD的相關信號通路。富集條件均設定為P<0.05。

2 結果

2.1 葛花解酒滌脂湯中候選化合物及其作用靶點篩選結果根據候選化合物的篩選條件，在ETCM和SymMap數據庫中收集到的葛花解酒滌脂湯中候選化合物數量分別如下：葛花、葛根、白茯苓、綿茵陳、小青皮、甘草、決明子、山楂、明礬中分別有74、6、6、33、13、49、15、4、1個候選化合物。共計201個候選化合物。

在Swiss Target Prediction數據庫中篩選出201個候選化合物對應靶點，依據成分的Canonical SMILES結構進行靶點預測，去除重復項后篩選出900個靶點作為葛花解酒滌脂湯的預測靶點。將所得的葛花解酒滌脂湯預測靶點與GeneCards數據庫獲取的3 763個AFLD相關靶點相映射，篩選出葛花解酒滌脂湯治療AFLD的候選作用靶點575個(圖1)。

2.2 PPI網絡分析及葛花解酒滌脂湯治療AFLD潛在活性化合物篩選結果將葛花解酒滌脂湯治療AFLD的575個候選作用靶點導入String數據庫，建立PPI網絡數據。此網絡共有575個節點，3 841條邊，網絡平均節點數13.4。通過Cytoscape軟件，對該PPI網絡進行分析，結果顯示其中自由度>50的靶點共有17個，選取這17個靶點作為葛花解酒滌脂湯治療AFLD的核心預測靶點(表1)。其中自由度>80的靶點為PIK3CA、PIK3R1、MAPK1和APP，該結果表明葛花解酒滌脂湯治療AFLD主要涉及PIK3CA、PIK3R1、MAPK1和APP四個關鍵靶點。這四個關鍵靶點涉及葛花解酒滌脂湯中的66個候選化合物，中藥-候選化合物-靶點網絡圖見圖2。但這66個候選化合物中，因部分化合物暫無法分離得到單體，因此葛花解酒滌脂湯治療AFLD的潛在活性化合物共有19個(表2)。

2.3 核心靶點的生物功能和通路富集分析運用Cytoscape(3.6.0)軟件中的ClueGo插件對篩選得到的葛花解酒滌脂湯治療AFLD核心靶點進行GO功能富集和KEGG通路富集分析，見圖4、5。在GO功能富集分析結果中，共確定了46個條目，其中與分子功能(molecular function)相關的有6條，涉及蛋白質磷酸化、蛋白質酪氨酸殘基磷酸化、胰島素受體底物結合、Tau蛋白結合等分功能；與生物學過程(biological process)相關的有40條，其中排名前十的生物學過程主要涉及吞噬過程中免疫應答調節的細胞表面受體信號通路、吞噬過程中Fc-γ受體信號通路、血管內皮生長因子受體信號通路、星形膠質細胞分化等方面。通過KEGG通路富集分析，共得到23條相關通路，其中炎癥相關通路有7條，激素相關通路4條；該結果提示葛花解酒滌脂湯治療AFLD可能是通過炎癥相關通路、激素相關通路、自噬、調節脂肪細胞脂解等信號通路調控。

表2 葛花解酒滌脂湯治療AFLD的潛在活性化合物

3 討論

在我國，酒精性肝病成為僅次于非酒精性脂肪肝的第二大導致肝硬化和肝細胞癌相關死亡的原因。脂肪肝是90%以上酗酒者對過量飲酒最早的反應，是酒精性肝病發展為AFLD的重要因素。

圖3 GO功能富集氣泡圖

圖4 KEGG通路富集氣泡圖

課題組前期研究已表明[1-2]葛花解酒滌脂湯對酒精性脂肪肝小鼠具有顯著的治療作用，但其治療AFLD的活性物質不清且作用機制不明。如果繼續沿用傳統的“一個靶點，一種疾病，一個藥物”的研究模式，已很難系統、整體地闡明葛花解酒滌脂湯治療AFLD的作用機制，并且還會耗費大量的時間、精力。隨著現代科技進入大數據時代，系統生物學和生物信息學等交叉學科的快速興起，國內外學者開始從復雜網絡的角度探索疾病與藥物的系統性研究方式，“網絡藥理學”這一新學科由此開端并得到快速發展。它基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用的網絡基礎，通過分析基因網絡庫、蛋白網絡庫、疾病網絡庫、藥物網絡庫等現有數據庫的信息資料，結合從實驗中獲得的數據，利用專業網絡分析軟件及算法，系統、整體的揭示疾病-疾病、疾病表型-靶點蛋白、靶點蛋白-藥物、藥物-藥物之間的聯系。且網絡藥理學注重藥物作用網絡及生物網絡的整體性和系統性，關注基因、蛋白等在生物網絡中的生物學地位和動力學過程，而并非對其作用單一靶標，認為藥物作用的是疾病病理網絡，以多維視角理解疾病和分析疾病，這一理念與中醫整體觀念一致。網絡藥理學能較好、較全面地運用于中藥治療疾病作用機制的研究，本研究采用網絡藥理學探索葛花解酒滌脂湯治療AFLD的作用機制。結果顯示，葛花解酒滌脂湯可能通過炎癥反應相關通路、激素相關通路、凋亡相關信號通路等信號通路防治AFLD。

本研究中KEGG富集到葛花解酒滌脂湯干預AFLD的相關炎癥通路共有7條，分別為Chemokine信號通路、C-type lectin receptor信號通路、Sphingolipid信號通路、FoxO信號通路、Inflammatory mediator regulation of TRP channels、TNF信號通路和IL-17信號通路。此外，還富集到凋亡、自噬和脂質代謝等通路，這些通路都可通過炎癥反應發揮其在AFLD中的作用[4-5]，因此，課題組認為葛花解酒滌脂湯治療AFLD主要是通過抗炎發揮其藥效作用。已有研究表明AFLD患者體內炎癥水平很高[6]，而改善腸道菌群是治療AFLD的手段之一[7]，且這種治療手段主要是通過抗炎發揮療效[8]。故而作者認為抗炎在葛花解酒滌脂湯治療AFLD中發揮了重要作用。

另外，本研究運用網絡藥理學的方法對葛花解酒滌脂湯抗AFLD的潛在活性化合物進行初探。結果顯示，葛花解酒滌脂湯中有19個化合物涉及PIK3CA、PIK3R1、MAPK1和APP四個核心靶點，所以作者認為這19個化合物可能是葛花解酒滌脂湯治療AFLD的潛在活性化合物，而其中喬松素[9]、柚皮素[10]、大黃酚、決明蒽醌和大黃素甲醚[11]、槲皮素[12]、山奈酚[13]、異甘草素[14]、染料木素[15]9個潛在活性化合物的抗ALFD活性已被相關文獻證實。余下10個化合物的抗ALFD活性有待進一步研究。

綜上所述，通過網絡藥理學的方法，從理論上不僅肯定了葛花解酒滌脂湯治療AFLD的有效性，還揭示了葛花解酒滌脂湯抗AFLD的潛在活性化合物。這一結果為進一步研究AFLD發生及葛花解酒滌脂湯干預作用機制提供指導依據。