LncRNA FGD5-AS1通過miR-873-5p/GTPBP4軸促進肝細胞癌發展的研究

章諾貝，黃神安，沈 浩，陳 新

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上與癌癥相關死亡的主要疾病之一。根據2018年《全球癌癥統計》，全球已診斷出約841 000例新的肝癌病例，并且全球已有782 000人死于肝癌[1]。目前，肝癌外科手術治療僅在這種疾病的初期有效。然而，大多數患者的肝癌在診斷明確時已發展到晚期，放療和化療療效有限。因此，有必要進一步了解肝癌進展的分子機制，并研發出針對肝癌更有效的靶向療法[2]。

近年來，越來越多的證據[3]表明LncRNAs作為癌癥患者診斷和預后的生物學標志物，為癌癥治療提供了新的治療靶點。有研究[4]表明LncRNA的異常表達在肝癌的發生和轉移中起著至關重要的作用，如MALAT1與腫瘤轉移有關，并可預測肝移植術后的復發[5]。此外，LncRNA-LET可抑制肝癌的侵襲和腹腔轉移[6]。FGD5反義RNA 1(FGD5 antisense RNA 1，FGD5-AS1)是一位于染色體3p25.1的新近被確認的LncRNA。最近，LncRNA FGD5-AS1初步被確定為肝癌的潛在治療靶標[7]；然而，LncRNA FGD5-AS1在肝癌發生發展中的調控作用仍不得而知。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本從在南昌大學第二附屬醫院接受手術的60例肝癌患者中，獲得腫瘤組織和鄰近配對正常組織。收集所有組織樣本并在液氮中冷凍，然后在-80 ℃下保存以備后用。

1.2 細胞培養從中科院上海細胞庫購買了4種肝癌細胞系，分別為HepG2、HuH-7、Li-7、SNU-387，以及正常人肝細胞系L02。將細胞系放在補充有10%胎牛血清(Invitrogen，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德公司)的RPMI 1640培養基(Invitrogen，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德公司)中，并在37 ℃、5%CO2的條件下培養。

1.3 細胞轉染分別用由上海GenePharma公司合成的FGD5-AS1過表達載體、FGD5-AS1shRNA(sh-FGD5-AS1)、NC shRNA(sh-NC)和GTPBP4 shRNA(sh-GTPBP4)、NC mimic、miR-873-5p mimic對HepG2和HuH-7細胞系進行轉染。sh-FGD5-AS1:5′-GAA CTCAGCGTTGACTATTCT-3′；sh-GTPBP4: GGATGTGCACAGTGATCAAGA；si-NC: 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。根據制造商說明使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德公司)進行轉染。采用RT-qPCR和綠色熒光顯微鏡評估轉染效率。

1.4 CCK-8和EdU分析通過CCK-8和EdU測定法檢測細胞增殖。根據制造商說明(上海Beyotime公司)，采用CCK-8分析，并在450 nm處測量吸光度(optical density,OD)值。同時按照制造商說明，使用EdU Apollo DNA體外試劑盒(廣州RIBOBIO公司)，通過EdU分析確定細胞增殖，并在熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.5 細胞劃痕實驗肝癌細胞種植到12孔板中，培養達到70%左右的融合度。接下來，利用一個50 μl小管的管尖部分造成劃痕。通過1×PBS除去沒有附壁的細胞。再次將細胞放入含有10% FBS的DMEM中分別培養0、48、72 h。每孔隨機選擇3個觀察范圍。

1.6 Transwell 實驗上室涂有基質膠，用于侵襲分析或未涂覆基質膠進行遷移分析。上室每孔有1 000個/孔濃度的細胞以及無血清培養基，底部腔室為含有10%FBS的DMEM。48 h后，通過使用4%甲醇固定細胞，然后用0.1%結晶紫(美國Sigma-Aldrich公司)染色。在5個不同的視野(放大100倍)中，分別對遷移和侵襲的細胞進行計數。

1.7 雙熒光素酶報告實驗使用GTPBP4野生型(wt)或突變型(mut)啟動子報告子與FGD5-AS1或miR-873-5p進行重組后轉染HepG2和HuH-7細胞系。轉染48 h后，使用雙熒光素酶報告檢測系統(美國威斯康星州Promega公司)檢測熒光素酶活性。

1.8 RNA下拉實驗將PierceTM磁性RNA-蛋白質下拉試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)用于RNA下拉實驗。首先將RNA結合到磁珠上，以接收用于蛋白質結合的RNA。此后，在添加蛋白質裂解物之前，RNA結合珠在蛋白質-RNA結合緩沖液中被平衡。通過添加適當的緩沖液洗滌珠子，在磁力架上渦旋后分離。最后，通過RT-qPCR分析測定沉淀物中RNA的特異性。

1.9 RT-qPCR使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)從組織樣品和細胞中提取總RNA。根據制造商協議，使用PrimeScriptTMRT試劑盒(日本Takara公司)將RNA反轉錄為第一鏈cDNA。通過FastStart Universal SYBR Green Master(德國Roche公司)對PCR定量擴增產物，并標準化為GAPDH和U6。引物：FGD5-AS1，(F)5′-GTCACTGTTCGGTG GTCTGC-3′，(R)5′-CAGTCAGGTGTTGTCGTGGAG-3′；miR-873-5p，(F)5′-GCAGGAACTTGTGAGTCTCC-3′，(R)5′-CTTGAACACTCAGAGGAAGG-3′； GTPBP4，(F)5′-GTTGCTAAAGATTATGTGCGACTG-3′，(R)5′-CAAACGGGATAAATGCTGACG-3′；GAPDH,(F)5′-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3′，(R)5′-TGTA TCCAAACTCATTGTCATAC-3′。

1.10 Western blot檢測使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液(美國Sigma-Aldrich公司)提取總蛋白。根據制造商說明，使用BCA蛋白分析試劑盒(上海)測定蛋白質濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白質，并將其轉移至PVDF膜(美國Millipore公司)，然后與一抗在4 ℃孵育過夜，其后與HRP偶聯的二抗(1 ∶5 000稀釋)孵育。用ECL Western blot檢測試劑(美國Millipore公司)對蛋白質進行可視化。免疫反應帶使用Image J(美國NIH公司)進行定量。

2 結果

2.1 FGD5-AS1在肝癌組織和細胞中表達情況首先通過RT-qPCR檢測FGD5-AS1在腫瘤組織和相應癌旁非癌組織中的表達。與癌旁正常肝組織相比，HCC組織中FGD5-AS1的RNA表達水平增加(圖1A)；與正常肝細胞L02相比，4種HCC細胞系(HepG2、HuH-7、Li-7和SNU-387)中FGD5-AS1的RNA表達水平也均有升高(圖1B)。RT-qPCR分析FGD5-AS1在HepG2和HuH-7細胞中的亞細胞定位，結果表明FGD5-AS1主要位于細胞質中(圖1C)。

圖1 FGD5-AS1在HCC組織和細胞中的表達

2.2 下調FGD5-AS1對HCC細胞增殖及凋亡的影響用sh-FGD5-AS1轉染后，FGD5-AS1在HepG2細胞系中的表達水平降低了70%，在HuH-7細胞系中的表達水平降低了65%(圖2A、B)。CCK-8和EdU檢測表明，下調FGD5-AS1可抑制HepG2和HuH-7細胞系的增殖能力(圖2C、D)。Western blot實驗表明，下調FGD5-AS1可使增殖相關標志物PCNA和CyclinD1表達蛋白水平降低(圖2E)。流式細胞儀檢測FGD5-AS1對細胞凋亡，FGD5-AS1的下調使膜聯蛋白V(Annexin V)陽性細胞的百分比在HepG2細胞中從8%增至24%，在HuH-7細胞中從7%增至20%(圖2F)。為了進一步證實FGD5-AS1對肝癌細胞凋亡的影響，采用Western blot檢測了4種凋亡標志物(Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9)的蛋白水平。如圖2G所示，在HepG2和HuH-7細胞系中，FGD5-AS1的表達沉默降低了Bcl-2的表達水平，而同時增加了Bax、cleaved caspase-3(abcam、ab2302)和cleaved caspase-9 (abcam、ab2324)的表達水平。

2.3 FGD5-AS1下調對HCC細胞的遷移和侵襲的影響細胞劃痕和Transwell實驗表明下調FGD5-AS1可以抑制HCC細胞遷移和侵襲(圖3A～C)。 在分子水平上檢測遷移/侵襲相關的蛋白Cox-2、MMP2和MMP9的表達水平變化，結果表明sh-FGD5-AS1組Cox-2、MMP2和MMP9的蛋白表達水平低于sh-NC組(圖3D)。以上實驗結果顯示，下調FGD5-AS1可抑制HCC細胞的遷移和侵襲。

2.4 FGD5-AS1在HCC細胞中靶向miR-873-5p情況通過搜索在線生物信息學數據庫來預測miR-873-5p是FGD5-AS1的潛在下游靶標(圖4A)。使用miR-873-5p mimic實現miR-873-5p過表達，并且通過RT-qPCR分析驗證了轉染效率(圖4B)。基因分析表明，將miR-873-5p mimic轉染到HCC細胞中可抑制帶有miR-873-5p結合位點的FGD5-AS1序列的螢光素酶報告基因的活性。在FGD5-AS1中的miR-873-5p的預測結合位點發生突變后，熒光素酶活性的變化被消除(圖4C)。此外，RNA下拉試驗進一步證實FGD5-AS1確實與HCC細胞中的miR-873-5p結合(圖4D)。此外， RT-qPCR分析顯示，HepG2和HuH-7細胞中的FGD5-AS1沉默后，miR-873-5p的表達水平升高(圖4E)。與非腫瘤組織和正常人肝細胞系L02相比，在腫瘤組織和HCC細胞系中，miR-873-5p表達水平顯著降低(圖4F、4G)。Pearson的相關性分析表明，miR-873-5p與FGD5-AS1呈負相關(圖4H)。這些數據為FGD5-AS1可海綿化miR-873-5p提供了證據。

圖2 下調FGD5-AS1對HCC細胞增殖及凋亡的影響

圖3 下調FGD5-AS1對HCC細胞的遷移和侵襲的影響

圖4 FGD5-AS1在HCC細胞中靶向miR-873-5p情況

2.5 FGD5-AS1通過與miR-873-5p競爭性結合對GTPBP4的影響使用Starbase v2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)分析表明GTPBP4是miR-873-5p的下游靶基因，存在潛在的結合序列(圖5A)。雙熒光素酶報告實驗表明，miR-873-5p可抑制野生型GTPBP4-WT的熒光素酶活性(圖5B)。RNA下拉實驗同樣表明，GTPBP4僅被Bio-miR-873-5p-wt下拉，進一步驗證了GTPBP4與miR-873-5p的相互作用(圖5C)。通過RT-qPCR和Western blot分析表明：miR-873-5p過表達可導致GTPBP4 mRNA和蛋白質水平明顯下降，證實了GTPBP4是miR-873-5p的靶標(圖5D、E)；miR-873-5p對GTPBP4熒光素酶活性的抑制作用可被GTPBP4的過表達所部分抵消(圖5F)；FGD5-AS1的表達下調可降低GTPBP4的mRNA和蛋白表達水平(圖5G、H)。

2.6 FGD5-AS1/miR-873-5p/GTPBP4軸在HCC中的作用為了進一步研究FGD5-AS1/miR-873-5p/GTPBP4軸對HCC的影響，課題組首先通過RT-qPCR證實了HepG2細胞系的轉染效率(圖6A)。CCK-8和EdU實驗顯示miR-873-5p抑制劑可使FGD5-AS1沉默引起的HepG2細胞增殖減少的效應增強，而此效應又可由GTPBP4的敲低所阻遏(圖6B、C)。流式細胞術分析細胞凋亡顯示miR-873-5p抑制劑可消除FGD5-AS1下調對細胞凋亡的影響，且當GTPBP4沉默后，細胞凋亡得以恢復(圖6D)。細胞劃痕和Transwell實驗分析表明，miR-873-5p抑制劑可增強FGD5-AS1下調對細胞的遷移和侵襲的抑制效應，而此效應又可通過抑制GTPBP4表達來恢復(圖6E、F、G)。上述結果表明FGD5-AS1可通過miR-873-5p/GTPBP4軸影響HCC細胞的生物學行為。

3 討論

本研究表明lncRNA FGD5-AS1在HCC組織和細胞中高表達，lncRNA FGD5-AS1競爭性地抑制miR-873-5p的表達，從而增強了HCC細胞中GTPBP4的表達水平。以上研究結果提示，lncRNA FGD5-AS1在促進HCC進程中發揮了推進作用，其可能作為HCC的一種新的治療靶標。

lncRNA FGD5-AS1已被確定為包括肝癌在內的多種癌癥的潛在致癌基因[8-12]。本研究顯示，lncRNA FGD5-AS1在HCC組織中的表達明顯高于相應的非腫瘤組織，lncRNA FGD5-AS1的表達下調可抑制HCC細胞的惡性表型，包括增殖、遷移和侵襲，結果表明lncRNA FGD5-AS1在HCC的發展中發揮著至關重要的促進作用。

圖5 FGD5-AS1與miR-873-5p競爭性結合對GTPBP4的影響

圖6 FGD5-AS1/miR-873-5p/GTPBP4軸在HCC中的作用

該研究表明lncRNA FGD5-AS1主要在HCC細胞質中表達，生物信息學分析顯示miR-873-5p具有與lncRNA FGD5-AS1互補的序列。根據先前的研究報道,miR-873-5p在多種癌癥中均具有抑癌作用[13]。因此，可推測lncRNA FGD5-AS1可通過與miR-873-5p相互作用從而發揮其致癌作用。本研究結果表明，lncRNA FGD5-AS1可負性調控miR-873-5p。此外，生物信息學分析表明，GTPBP4可能是miR-873-5p的下游靶標。在最近的研究中，GTPBP4已被報道可促進包括HCC在內的多種癌癥的進展[14-15]。然而，在HCC中miR-873-5p和GTPBP4的關系尚不清楚。在本研究中，通過熒光素酶報告實驗和RNA下拉實驗，證實了GTPBP4是miR-873-5p的直接靶標。此外，拯救分析結果表明，lncRNA FGD5-AS1可通過miR-873-5p/GTPBP4軸促進HCC的發展，但是，需要更多的體內實驗來進一步證實研究結果。

該研究為lncRNA FGD5-AS1在HCC進展中發揮重要作用提供了理論依據。此外，lncRNA FGD5-AS1/miR-873-5p/GTPBP4軸為肝癌的分子基礎研究預示了新視角，并為開發新的HCC診斷和治療策略提供了新的前景。