精細化檢測原代皮質神經元細胞氧糖剝奪再復氧后自噬流的變化

張 磊，戴 朝，韓延峰，李 陽，胡玉奇，陳富雷，趙 冬

自噬關乎于人類健康并且涉及到多種疾病的多種層面[1-2]。它被認為是一種動態結構性的溶酶體過程[3-4]，這些連續動態變化的過程被稱為自噬流[5]，其中任一環節出現障礙，自噬將無法完成應有的生物學功能進而引發和罹患多種疾病。

目前自噬流研究領域的熱點是從自噬角度去解釋和治療一些疾病[6]，為此建立高精細靈敏的檢測自噬流方法必不可少。最近有報道[3, 7]用LC3 ELISA定量自噬流和用電子透射顯微鏡(TEM)觀察線粒體自噬流，但它們只能測量自噬是否增加或減少而不能測量隨時間變化的動力學；且每種方法對自噬流的不同階段檢測均存有差異。該研究在原代皮質神經元細胞氧糖剝奪再復氧(oxygen-glucose deprivation-reoxygenation, OGD/R)模型上，加或者不加BafA1干預后采用多種方法反復檢測自噬流變化，掌握各種方法的優缺點后能在自噬發生的不同時期選擇最合適的方法去研究自噬流。

1 材料與方法

1.1 大鼠皮質神經元的原代培養原代皮質神經元來源于24 h內出生的健康SD乳鼠，購自新疆動物中心。將分離好的皮質神經元接種在提前包被好的多聚賴氨酸(0.1 mg/ml)(上海生工生物工程有限公司)的六孔板中，細胞種植密度為2×106個/孔，用含有Neurobasal、2% B27、Glutamax、10% FBS(美國Gibco公司) 和青鏈霉素(美國Hyclone公司)的完全培養基, 置于37 ℃，5% CO2的細胞培養箱中培養，培養至第7天選用皮質神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)(美國Abcam公司 )結合免疫熒光法檢測皮質神經元純度，定量陽性細胞比例證實純度>90%可用于實驗。

1.2 免疫熒光將培養至第7天成熟的生長狀態良好的皮質神經元，用4%多聚甲醛固定30 min，后用0.1% Triton-x100透化皮質神經元20 min，用PBS清洗，5%脫脂牛奶封閉緩沖液30 min后棄去封閉液, 神經元鑒定實驗中加入一抗NSE(1 ∶100)，p62免疫染色實驗中加入一抗p62(美國Abcam公司)(1 ∶200)，4 ℃孵育過夜，第2天用PBS清洗，后與FITC偶聯的二抗(北京中杉金橋有限公司)孵育2 h，細胞核用PI(美國Sigma公司)染色，再用熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)進行觀察。

1.3 OGD/R與藥物治療皮質神經元共同剝奪O2和葡萄糖1 h，模擬在體外的損傷模型[8]，去除原來的培養基后在六孔板內加入無糖培養基DMEM(武漢普諾賽生命科技有限公司)，將盛有細胞的六孔板置于缺氧小室(美國比盧普斯羅森堡公司)中，在95% N2和5% CO2的飽和氣體中，氧濃度維持在1%以內，溫度控制在37 ℃，OGD損傷后，更換為最初的完全培養基，放入37 ℃，5% CO2的細胞培養箱中常規培養24 h。其中OGD/R組不做處理；BafA1組在OGD/R組的基礎上將BafA1(100 nmol/L)(美國Selleck公司)注入六孔板內處理細胞4 h，所有分組在相同條件下共同再灌注24 h。

1.4 RFP-GFP串聯熒光標記LC3基因轉染細胞應用LC3雙熒光腺病毒轉染原代皮質神經元細胞 (上海吉凱公司)，細胞在24孔板內以2.5×105個/孔的密度培養7 d，將此類腺病毒按照課題組計算好的標準加入各分組試驗感染細胞后處理，感染皮質神經元細胞24 h后用熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)觀察，人工計數黃色和紅色LC3點，每組隨機抽取至少有50個細胞進行定量。

1.5 TEM觀察自噬超微結構變化培養7 d生長狀態良好的成熟皮質神經元進行OGD/R實驗處理24 h后，加入0.25%的胰酶進行細胞消化4℃離心機1 000 r/min離心5 min，棄去上清液后加入500 μl 2.5%戊二醛固定液4℃固定后采用JEM 1200EX(日本JEOL公司)電子顯微鏡觀察自噬體、溶酶體、自噬溶酶體的超微結構。

1.6 Western blot將OGD/R組的細胞培養液吸出，細胞裂解產物用含有蛋白酶抑制劑的RIPA在冰上裂解細胞30 min，收集標本，在4℃以下12 000 r/min離心15 min，5%脫脂牛奶在室溫下進行封閉1h，用8%～10%的SDS-PAGE實施分離蛋白，隨即轉移到PVDF膜上，之后與抗LC3(美國Abcam公司) (1 ∶1 000)，抗p62(美國Abcam公司)(1 ∶1 000)的抗體，4℃孵育過夜，用增強型化學發光法(electrochemiluminescence，ECL)觀察免疫印跡，對蛋白條帶進行密度分析。在SQSTM1/p62結合LC3蛋白翻轉實驗中，用兩組間可溶性p62的比值，不可溶性p62的比值(常規細胞經裂解離心后在離心沉淀中加入高濃度的尿素，從而獲得了不可溶性p62)同時結合LC3Ⅱ/Ⅰ的比值評價自噬流，并將其歸一化為β-actin。 Western blot結果用ImageJ軟件進行定量。

2 結果

2.1 皮質神經元的鑒定成功培養7 d后的皮質神經元細胞進行免疫熒光鑒定，神經元的軸突和胞質經NSE染色后發綠色熒光，細胞核經PI染色后發紅色熒光，兩種免疫熒光的共存表明皮質神經元占所培養細胞總數的95%以上(圖1)。

2.2 皮質神經元在OGD/R模型成功建立后自噬流的活化RFP-GFP-LC3B串聯熒光標記LC3基因轉染神經元細胞后熒光顯微鏡下觀察紅色/綠色共定位的點狀聚集，當RFP和GFP圖像疊加時，熒光下黃點(RFP和GFP共存)代表自噬小體，紅色熒光點表示自噬溶酶體，紅色和黃色的比值用來測量自噬流。在OGD/R組中紅點的總體數量明顯多于黃點的總體數量且紅點和黃點的比值明顯偏高，而在BafA1組顯示無論紅點還是黃點的總數量均出現明顯減少且紅點幾乎難以被檢測到(圖2A)，綜上所述，在熒光顯微鏡下觀察到的紅色/綠色共定位點狀聚集時OGD/R組紅點和黃點的比值明顯高于BafA1組(t=20.37，P<0.001)(圖2B)。

2.3 TEM觀測神經元OGD/R后自噬超微結構變化在TEM下觀察到OGD/R組與BafA1組自噬小體和溶酶體的超微結構狀態。OGD/R組自噬小體(雙層膜結構清晰)、溶酶體(染色質深較聚集)、自噬溶酶體增多(圖3A、B)。在BafA1組中觀察到很少的自噬小體(膜已破壞結構不清)和降解的溶酶體，幾乎未見到自噬溶酶體(圖3C、D)。TEM下觀察OGD/R組時自噬超微結構清晰典型，而在BafA1處理組中觀察到的結構模糊缺乏典型特征。

2.4 SQSTM1/p62結合LC3B蛋白翻轉實驗共同評定自噬流變化課題組同時觀察了可溶性p62蛋白、不可溶性p62蛋白和LC3Ⅰ/Ⅱ的轉化綜合判斷自噬流的變化(圖4)。在OGD/R組與BafA1組的實驗中，OGD/R組的可溶性p62明顯低于BafA1組(0.58±0.02)(t=24.66，P<0.05)，而不可溶性p62蛋白兩組之間比較幾乎無明顯變化；其次，清晰地觀察到OGD/R組的LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化明顯增加(0.87±0.02)(t=9.055，P<0.05)(圖4C、D),最終結果顯示OGD/R組細胞內的自噬流明顯活躍于BafA1處理組。

圖1 NSE和PI雙重免疫熒光染色的代表性顯微圖片 400

圖2 RFP-GFP-LC3串聯熒光檢測自噬流(×200)A：轉染皮質神經元細胞后的活細胞圖像；B：不同組的LC3的數量；與OGD/R組比較：***P<0.001

圖3 TEM下觀察自噬超微結構的變化 ×5 000

2.5 免疫熒光細胞化學染色p62的分布觀測自噬流p62蛋白經免疫熒光染色后分布在細胞質，顯微鏡下觀察到神經元細胞內p62不同形態的含量變化及在細胞內的定位，與OGD/R組相比，彌散型p62和聚集型p62的分布與含量在BafA1組中尤為顯著(圖5)。

圖4 SQSTM1 / p62 結合LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ轉化實驗分析細胞自噬流

圖5 免疫熒光染色分析神經元細胞中p62蛋白的變化判斷自噬流 ×400

3 討論

目前雖有多種方法用于檢測自噬流，但是在自噬的不同階段如何準確應用相應方法尚不明確，每種方法的優缺點也不詳細。因此，精準檢測自噬流已成為一種緊迫的需求和挑戰。課題組用動態檢測(RFP-GFP串聯熒光基因轉染)和靜態檢測(TEM、p62結合LC3蛋白翻轉、p62免疫熒光)方法觀察神經元在OGD/R后的自噬流，在加或不加BafA1的情況下，自噬流顯現了兩種截然不同的趨勢，OGD/R后自噬流激活，加入BafA1后自噬流中斷，且不同的方法檢測了自噬過程的不同階段。

RFP-GFP-LC3B串聯熒光轉染細胞是研究自噬流不可或缺的利器，也是觀察RFP-GFP-LC3B融合蛋白的最佳儀器[9]。本實驗用此技術后發現在OGD/R組中紅點的數量明顯多于黃點，提示自噬流激活，有學者用此方法得到了類似的效果[10- 11]。而加用自噬晚期抑制劑BafA1后黃點數量明顯增多，說明自噬流中斷。此實驗最大的優勢就是僅通過熒光強度的改變就可以觀測自噬流的狀態[5]。但這種方法僅能檢測到自噬的某一階段，要想充分評價自噬流的變化需要用動態的方法去檢測，比如在活細胞工作站下觀測。

TEM是檢測自噬流最經典的方法[7]。實驗顯示OGD/R組，自噬小體、溶酶體、自噬溶酶體結構清晰且數量較多，而加入 BafA1后未見到完整的自噬小體，也未發現自噬溶酶體結構。TEM在納米分辨率下可視自噬體、溶酶體、自噬溶酶體等超微結構，以及它們所處細胞成份的確切位置，甚至還提供了自噬完整過程的快照及超微結構的變化[12]。但是要想觀察連續動態的圖像需要和熒光傳感器和免疫方法耦合。

完整的自噬流是將p62與LC3B相結合同時進行檢測，這是目前判斷自噬流最為準確的方法[5, 13]。通常LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化，或LC3Ⅱ含量增多代表自噬流激活，LC3Ⅱ含量減少意味著自噬流的終止。p62被稱為選擇性自噬受體，它可與溶酶體融合形成自噬溶酶體而最終被清除。自噬流激活時p62水平降低，自噬流中斷時p62水平升高[11]。另外，若可溶性p62蛋白減少不可溶性p62蛋白無明顯變化，且LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化意味著自噬流激活；若可溶性p62蛋白減少不可溶性p62蛋白明顯增加，無論LC3Ⅰ是否向LC3Ⅱ轉化都證明自噬流中斷[14]。實驗顯示OGD/R組的可溶性p62明顯低于BafA1組，而不可溶性p62蛋白之間無差異；OGD/R組的LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化，說明OGD/R后神經元細胞內的自噬流激活，加入BafA1后自噬流停滯。將p62結合LC3B同步檢測自噬流觀察的不僅有前期自噬小體形成過程還涉及到自噬流后期自噬溶酶體的降解，所以說是判斷自噬流最為準確的方法[15]。

然而，自噬流也會出現波動。當自噬流發生波動時，可溶性與不可溶性p62會滯后，為此通過p62免疫染色聯合Western blot可更為合適的去判斷自噬流[15]。實驗中加或不加BafA1觀察到彌散型p62和聚集型p62的分布有明顯差異，正好與Western blot的結果相匹配，此方法反映了自噬流的最后環節——自噬溶酶體的降解。

總之，為了檢測神經元OGD/R后自噬流的變化，課題組采用多種方法綜合評價，不同方法監測了自噬流的不同階段，可以利用每種方法各自的優點去互補，根據自噬發生的不同時期選擇最合適的方法去研究自噬流。